崔騰飛，王 晨，譚紅雨，賈海鋒，白云赫，王文然，房經(jīng)貴

(1.南京農業(yè)大學 園藝學院，江蘇 南京 210095；2.中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

白藜蘆醇(Resveratrol)，簡稱Res，早在1924年就被發(fā)現(xiàn)[1]，化學名稱為3，4′，5-三羥基-1，2-二苯乙烯(3，4′，5-trihydroxystilbene)，分子式C14H12O3，相對分子質量228.25[2]，其存在順式和反式2種類型[3]。白藜蘆醇是在植物體內受到了病原體侵染或者在惡劣環(huán)境條件下，植物體內自身分泌的一種抗毒素[4]，具有增強植物抗逆性的作用。白藜蘆醇廣泛存在各種植物體中，其中在葡萄科植物中白藜蘆醇含量較高[5]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Res具有很強的預防和抑制心血管疾病及抗癌作用[6]。另外，它還具有如抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝聚、抗細菌和真菌等醫(yī)療保健作用。因此，白藜蘆醇已成為科學家們高度重視的天然活性成分[7]。目前，很多國家和地區(qū)都開發(fā)生產了白藜蘆醇及其制品并應用于食品、醫(yī)療保健品和化妝品等領域。比如，日本將白藜蘆醇作為食品添加劑，美國將白藜蘆醇納入膳食補充劑，我國也將白藜蘆醇制成了天然保健食品[8-10]。

白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，目前至少已在21科、31屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)[11]。其廣泛存在于自然界中，包括葡萄、虎杖[12]、花生[13-14]、豆類[15]等植物或果實中均有存在。在現(xiàn)有報道中，葡萄中含量較高，但在葡萄不同部位中白藜蘆醇含量不同，而葡萄皮是白藜蘆醇的主要合成部位。盡管葡萄中白藜蘆醇的含量相對較高，但是作為一種次生代謝物質，自然條件下在植物體內的含量相對較低，所以僅僅以目前栽培的天然葡萄果實為白藜蘆醇的來源遠遠滿足不了人們的需求，欲實現(xiàn)葡萄中白藜蘆醇的高效富集，很有必要認識葡萄中白藜蘆醇代謝的調控機制。而白藜蘆醇的合成受到苯丙氨酸裂解酶(PAL)、4-香豆酸：輔酶A連接酶(4CL)、肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)、二苯乙烯合酶(STS)、赤松素-甲氧基轉移酶(PMT)甚至查爾酮合成酶(CHS)等多個酶促反應的調節(jié)控制，其中最關鍵的調節(jié)酶是白藜蘆醇合酶(Rs)。Rs又被稱為3，4′，5-三羥基二苯乙烯合酶，為酮二聚物，是STS中的一類[16]。因此，研究葡萄Rs基因在白藜蘆醇代謝過程中的調控作用顯得尤為重要，而巨峰葡萄作為目前生產中栽培最廣的品種，且巨峰葡萄Rs基因相關的研究鮮有報道，故本研究對巨峰葡萄開展了Rs基因的初步研究，以期為認識Rs基因在葡萄白藜蘆醇代謝過程中的調控作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試巨峰葡萄(Vitisviniferacv.Kyoho)果實均采自江蘇農博園葡萄種植基地，分別為花后25，40，60，80 d不同成熟度的葡萄果實。

試驗所用試劑主要有：Tris、山梨醇、PEG、CTAB、NaCl、EDTA、KAc、C2H2OH、氯仿、LiCl、異丙醇，以及由TaKaRa生物工程有限公司生產的RNA反轉錄試劑盒、PCR產物純化試劑盒和捷倍思生物基因技術有限公司的DNA凝膠回收試劑盒，此外還有Taq酶、T4DNA連接酶和限制性內切酶。主要載體有pMD19-T和pCAMBIA1302。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄總RNA的提取及cDNA合成 采用改良CTAB法[17]提取巨峰葡萄不同時期果肉和果皮中總RNA。用紫外分光光度計測定總RNA的OD260和OD280，通過比值大小判定其濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA完整度，如圖1所示，提取的總RNA條帶較為清晰，可進行后續(xù)試驗。然后將RNA按照TaKaRaPrimeScriptTMRT-PCRKit操作說明進行反轉錄合成cDNA。

圖1 巨峰葡萄果皮和果肉總RNA電泳Fig.1 Total RNA electrophoresis of peel and pulp of Kyoho grape

1.2.2 PCR擴增引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中已報道的葡萄Rs基因序列，基本信息如表1所示，設計PCR擴增引物：上游引物rs1：5′-ATGGCT

TCAGTCGAGGAATTTA-3′；下游引物rs2：5′-TTAAT

TTGTAACCATAGGAACGCTATG-3′。根據(jù)載體pCAMBIA1302，選取BglⅡ和NheⅠ 2個酶切位點，加酶切后上游引物rs3：5′-GAAGATCTATGGCTTCAG

TCGAGGAATTTA-3′；下游引物：rs4：5′-CTAGCTAGC TTAATTTGTAACCATAGGAACGCTATG-3′。引物由擎科生物有限公司合成。

表1 葡萄Rs基因基本信息Tab.1 Basic information on the Rs gene of grapes

1.2.3 目的基因的克隆 以反轉錄得到的cDNA為模板，擴增巨峰葡萄Rs的序列。使用25.0 μL的PCR反應體系：10×PCR緩沖液2.5 μL，提取的樣品Cdna 2.0 μL，上游引物rs1(25 mmol/L)1.0 μL，下游引物rs2(25 mmol/L)1.0 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.2 μL，滅菌的無核酸重蒸水17.8 μL，離心混勻。在PCR儀中94 ℃預變性5 min后，按以下程序進行PCR擴增：94 ℃變性30 s，53～64 ℃的溫度梯度退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min結束反應。然后瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，如圖2-A所示。按照膠回收試劑盒說明回收DNA，以回收產物為模板利用引物rs3和rs4進行PCR擴增，PCR擴增產物凝膠電泳如圖2-B所示，將PCR產物純化回收并連接pMD-19T載體，16 ℃連接過夜后轉化大腸桿菌進行測序。

A.以rs1/rs2為引物，使用RT-PCR擴增的目的基因片段，約為1 200 bp；B.將目的片段回收以rs3/rs4為引物擴增后的片段，即加酶切位點后的片段。A.rs1/rs2 is used as a primer，and the target gene fragment amplified by RT-PCR is about 1 200 bp; B.The fragment of interest is recovered by rs3/rs4 as a fragment amplified by the primer，that is，the fragment after the restriction enzyme site is added.

1.2.4Rs基因生物信息學分析 應用網(wǎng)站ORF Finder(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找開放閱讀框(Open reading frame，ORF)；利用NCBI在線軟件Blast搜索比對，下載其他植物相似性高的氨基酸序列，使用MEGA 5.0軟件根據(jù)相鄰連接方法(Neighbor jointing，NJ)構建系統(tǒng)進化樹并分析利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對葡萄Rs蛋白進行基序預測。使用在線軟件ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質理化性質及氨基酸組成；分別用在線軟件SOPMA和Swiss-Model等對Rs蛋白進行二級結構分析，對其三級結構建模并進行不同物種間對比分析；利用在線軟件STRING(https：//string-db.org/cgi/input.pl? UserId=input_page_show_search=on)對Rs基因進行蛋白互作分析；采用WoLF PSORT(http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)進行亞細胞定位；利用PlantCARE對獲得的葡萄Rs基因啟動子序列進行了順式作用元件的分析及功能預測并分析啟動子的motif作用類型和數(shù)量。

1.2.5 基因表達特異性分析 采用qRT-PCR技術，用試劑盒以及iQTM5Software和iQTM5Real-timePCRSystem分析不同發(fā)育階段葡萄果皮和果肉中目的基因的表達特性。根據(jù)克隆獲得的目的基因序列設計引物，上游引物序列為：5′-GGCTTTTGA

CCCACTTGGTA-3′；下游引物序列為：5′-GTGGCTTT

TTCCCCCTTTAG-3′，以葡萄的actin基因(登錄號：XM_019223591.1)為內參基因，上游引物序列為：5′-TACAATTCCATCATGAAGTGTGATG-3′；下游引物序列為：5′-TTAGAAGCACTTCCTGTGAACAATG-3′。擴增體系總體積為20.0 μL，其中cDNA模板1.0 μL、上、下游引物各0.4 μL、2×Supermix 10.0 μL、雙蒸水8.2 μL。擴增程序為：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s,55 ℃退火15 s，共40個循環(huán)；72 ℃保溫10 s。繪制熔解曲線，并根據(jù)2-ΔΔCT計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 巨峰葡萄Rs基因克隆及序列進化分析

2.1.1Rs基因克隆及序列分析 為研究Rs的潛在作用，開發(fā)其利用價值，本研究以巨峰葡萄cDNA為模板，利用引物rs1和rs2進行PCR擴增，得到序列為1 539 bp。經(jīng)測序、分析，該序列含有一個完整的開放閱讀框，其大小是1 179 bp，共編碼392個氨基酸。如圖3所示，該序列含有查耳酮和二苯乙烯合酶活性位點RVMLYHQGCYAGGTVLR，并具有完整的芪合酶家族特征位點GVLFGFGPGLT，該蛋白屬于查耳酮合酶家族，結構域序列號為cl28398，結構域匹配E值為0e+00。

三角形表示起始密碼子和終止密碼子；單下劃線表示芪合酶家族特征位點GVLFGFGPGLT；雙下劃線表示查耳酮和二苯乙烯合酶活性位點。The triangle indicates the start codon and the stop codon; the single underline indicates the stilb enzyme family signature GVLFGFGPGLT; the double underline indicates the chalcones and stilbene synthase active sites.

2.1.2 系統(tǒng)進化分析 通過在NCBI中Blast搜索比對類似序列，采用MEGA 5.0軟件對巨峰葡萄Rs基因編碼的氨基酸序列同擬南芥、番茄、草莓等植物的同源序列比對，并構建系統(tǒng)進化樹分析其保守性。如圖4-A所示，巨峰葡萄Rs基因與圓葉葡萄(ACM 47246.1)氨基酸序列一致性高達99%，與番茄(NP 001234033.2)氨基酸序列一致性為76%，與草莓(XP 004306542.1)和落花生(AID 59203.1)氨基酸序列一致性均為74%，而與擬南芥(NP 196897.1)氨基酸序列一致性為73%。證明Rs基因在葡萄屬中保守性較高，而在不同屬之間存在一定差異，但差異不大。

A．葡萄Rs基因構建的進化樹；B.葡萄Rs蛋白基序的MEME分析。A.Phylogenetic tree constructed from grape Rs gene;B.MEME analysis of grape Rs protein motifs.

基于Rs基因進化分析，本研究用MEME軟件構建了蛋白基序結構圖(圖4-B)。研究發(fā)現(xiàn)，巨峰葡萄Rs基因與同屬的圓葉葡萄(Vitisrotundifolia)蛋白長度和蛋白基序位置一致性較大，并且與不同屬之間差異較小，進一步表明葡萄Rs基因在分子結構進化中具有較高的保守性。

2.2 Rs基因生物信息學分析

2.2.1 Rs蛋白質理化性質及氨基酸組成分析 通過表2可以看出，巨峰葡萄Rs編碼392個氨基酸；分子質量為42.88 ku，理論等電點pI為6.09；在編碼蛋白中，酸性氨基酸所占比例高于堿性氨基酸；不穩(wěn)定系數(shù)小于40，故為穩(wěn)定性蛋白；親水性平均值為-0.047，則該蛋白屬于弱親水性蛋白。

2.2.2 Rs蛋白二級結構分析 蛋白質二級結構是構成其高級結構的基礎，主要包括4種基本形式：α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲，此外也包含延伸鏈等其他形式[18]。如表3和圖5所示，從二級結構分析預測結果能夠看出，巨峰葡萄Rs蛋白的二級結構組成和分布為，α-螺旋為44.13%，β-轉角為11.48%，無規(guī)則卷曲為26.79%，延伸鏈為17.60%。巨峰葡萄Rs蛋白二級結構主要成分是α-螺旋。

表2 巨峰葡萄Rs蛋白理化性質Tab.2 Kyoho grapes Rs protein physical and chemical properties

注：不穩(wěn)定指數(shù)中S(Stability)表示穩(wěn)定，I(Instability)表示不穩(wěn)定。

Note：The unstable index S(Stability)express stable，I(Instability)express is not stable.

表3 巨峰葡萄Rs蛋白二級結構預測Tab.3 Prediction of secondary structure of Rs protein in Kyoho grapes %

圖5 巨峰葡萄白藜蘆醇合酶基因編碼蛋白二級結構分布Fig.5 Secondary structure map of resveratrol synthase gene encoding Kyoho grapes

2.2.3 Rs蛋白三級結構分析 蛋白質三級結構是在二級結構基礎上進一步的盤繞折疊形成的，分析預測蛋白質三級結構有利于更加深入地了解Rs基因，開發(fā)其潛在的利用價值。故利用在線軟件Swiss-Model，對巨峰葡萄Rs蛋白進行了三維結構建模，并且將其和同屬的圓葉葡萄以及親緣關系較遠的落花生進行比較。如圖6，建模結果顯示，巨峰葡萄Rs蛋白三級結構與親緣關系近的圓葉葡萄相似性較高，而與親緣關系較遠的落花生存在明顯差異。進一步證明Rs基因在葡萄屬中具有較高的保守性。

A、B、C分別為圓葉葡萄、巨峰葡萄和落花生蛋白的三級結構。A，B，C，respectively the Round leaf gropes，Kyoho grapes and peanut protein tertiary structure.

2.2.4 Rs蛋白互作預測 通過蛋白互作預測發(fā)現(xiàn)Rs與5個蛋白有共表達，其中有4個為假定蛋白，一個為氧-甲基轉移酶(OMT2.1)。預測發(fā)現(xiàn)這些蛋白的功能可能與次生代謝相關。如圖7所示，其中VIT_12s0028g01880.t01基因編碼氧-甲基轉移酶(OMT2.1)，可催化白藜蘆醇生物合成紫檀芪，紫檀芪是一種主要存在于紫檀、藍莓、葡萄和花櫚木等植物的有效成分，具有抗真菌和一定的藥理學性質，在抗癌、抗氧化等方面具有一定的功效。 故推測Rs與OMT2.1在植物受到病原體侵染時將會高表達以增加植物的抗性。

2.3 亞細胞定位及啟動子分析

2.3.1 葡萄Rs基因亞細胞定位預測 如表4所示，亞細胞預測表明：巨峰葡萄Rs基因主要集中在細胞質和葉綠體中表達，而在高爾基體和液泡中均不表達，此外巨峰葡萄Rs基因在細胞核、線粒體、細胞膜和過氧化物酶體中有少量表達。故推測可知，Rs基因表達部位、表達量不同可能與葡萄不同組織中白藜蘆醇的含量具有一定的相關性。

圖7 Rs蛋白互作分析Fig.7 Rs protein interaction analysis

表4 巨峰葡萄Rs基因亞細胞定位預測Tab.4 Kyoho grapes Rs gene subcellular localization prediction

注：A.細胞質；B.高爾基體；C.葉綠體；D.細胞核；E.線粒體；F.液泡；G.細胞膜；H.過氧化物酶體。

Note：A.Cytoplasm;B.Golgi apparatus;C.Chloroplast;D.Nucleus;E.Mitochondria;F.Vacuole;G.Plasma membrane;H.Peroxisomes.

2.3.2 葡萄Rs基因啟動子的motif分析 利用PlantCARE對獲得的巨峰葡萄Rs基因啟動子序列進行了順式作用元件的分析及功能預測。序列分析顯示，該啟動子序列具有典型的核心啟動子元件，有32個CAAT-box和50個TATA-box，其中CAAT-box決定了啟動子起始轉錄的效率及頻率，可增強啟動子的強度[19]。除此之外，如表5所示巨峰葡萄Rs啟動子區(qū)片段還包含了光響應元件、參與晝夜節(jié)律控制的順式作用調控元件、赤霉素響應元件、參與脫落酸反應的順式作用元件和MYB Hv1和MYB結合位點以及真菌誘導反應元件，并且具有參與胚乳表達的順式調控元件。因此推測，巨峰葡萄Rs基因的表達可能受光照、激素、MYB的調控以及真菌的誘導，并且在胚乳中表達可能具有一定的時空特異性。對巨峰葡萄白藜蘆醇合酶基因的motif進行分析發(fā)現(xiàn)，如圖8所示，從圖中可以看出，與激素相關的motif主要兩類，分別是與赤霉素(GA)和水楊酸(SA)響應相關的motif，推測Rs基因能夠響應GA和SA，也進一步表明Rs基因的表達可能受激素的調控。

表5 巨峰葡萄Rs基因啟動子序列順式作用元件分析Tab.5 Kyoho grapes Rs gene promoter sequence cis-acting element analysis

圖8 巨峰葡萄Rs基因motif分析Fig.8 Motif analysis of Rs gene in Kyoho grape

2.4 Rs基因的表達特異性分析

采用qRT-PCR技術對巨峰葡萄果實和果皮不同生長發(fā)育階段中Rs基因的相對表達量進行檢測，結果如圖9所示，Rs基因在葡萄4個不同生長發(fā)育階段(青：花后25 d；微紅：花后40 d；全紅：花后60 d；深紅：花后80 d)的果皮和果肉中均有表達，但表達量有所差異；除在葡萄花后80 d之外，其余3個時期葡萄果皮中Rs基因的表達量均高于果肉；花后25 d時Rs基因的表達量在不同組織中均是最高，之后都有不同程度的變化。綜合來看，Rs基因的表達量在巨峰葡萄花后25 d的果皮中表達量最高，之后隨著果實顏色的加深，其表達量逐漸減少，到花后80 d時達到最低。定量結果表明，Rs基因在巨峰葡萄果實發(fā)育過程中的表達具有時空特異性。

圖9 不同生長發(fā)育階段巨峰葡萄果實中Rs基因相對表達量比較Fig.9 Comparison of Rs gene expression in Kyoho grapes at different growth and development stages

3 結論與討論

隨著人們對白藜蘆醇的認識逐漸加深，白藜蘆醇的開發(fā)利用也愈發(fā)廣泛。同時伴隨著葡萄副產品的研發(fā)，葡萄酒、果醋等產品層出不窮。白藜蘆醇不僅是植物自身分泌的抗毒素，能使植物對某些疾病產生抗性，而且對人體具有重要的保健作用。有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄果醋中富含大量的白藜蘆醇[20]，經(jīng)常食用能夠增強機體抵抗力，王茜等[21]、熊赪等[22]發(fā)現(xiàn)葡萄果醋中的白藜蘆醇具有防癌抗癌的作用。然而Rs基因是白藜蘆醇合成途徑中最后一個起重要作用的關鍵酶[23]，其屬STS中的一類。伴隨著人們對白藜蘆醇了解的逐漸深入，Rs基因的研究也早已倍受科學家們的關注。

現(xiàn)已在虎杖、花生和豆類等多種植物中克隆得到Rs基因，不同來源的Rs基因在結構存在一定的差異，當然其合成Res的能力也不同，因此關于Rs基因的研究十分活躍[24]。白藜蘆醇在葡萄中含量豐富，特別是在葡萄皮和葡萄籽中的含量尤其豐富[25]。然而以往對葡萄果實生長發(fā)育過程中白藜蘆醇的研究發(fā)現(xiàn)，既有研究表明Res含量從果實綠果期到成熟期穩(wěn)定下降[26]，也有在成熟期最高的結果[27]。此外，余興[28]和代紅軍等[29]研究表明，在釀酒葡萄蛇龍珠和赤霞珠葡萄生長發(fā)育過程中，果實中白藜蘆醇的變化趨勢呈雙峰型。因此，探究白藜蘆醇在葡萄果實生長發(fā)育過程中的變化趨勢顯得更加重要。本研究發(fā)現(xiàn)，在巨峰葡萄果實不同生長發(fā)育階段Rs基因在果皮和果肉中均有表達，且整體呈穩(wěn)定下降趨勢。主要表現(xiàn)為隨著葡萄果實顏色的加深，果皮中表達量遞減，而果肉中基本穩(wěn)定不變。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，同屬于歐美雜種的峰后和藤稔果皮中白藜蘆醇含量的最高時期均出現(xiàn)在轉色前的始熟期，且成熟時著色越深果皮中白藜蘆醇含量下降越快[30]，然而，鄭先波等[31]同我們研究發(fā)現(xiàn)相左；同時，Jeandet等[32-34]認為Res合成能力在果實成熟期驟然下降，源于葡萄不同生長期Res和花青素苷合成競爭關系，出現(xiàn)了Res合成能力的下降伴隨著一系列花青素苷物質的升高現(xiàn)象。本研究主要從鑒定巨峰葡萄Rs基因、蛋白功能分析和預測以及白藜蘆醇在葡萄果實中的時空表達特異性進行分析，研究發(fā)現(xiàn)Rs基因主要在細胞質和葉綠體中表達，且與OMT2.1具有互作。此外，Rs基因表達可能受光照、MYB、真菌和激素的調控，并且具有一定的時空特異性，主要表現(xiàn)為花后25 d的青皮中表達量最高。