楊艷艷，喬松林，李 睿，郭軍慶，李青梅，滕 蔓，王 麗，趙 東，李學(xué)伍，鄧瑞廣，張改平，2

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的一種豬的重要傳染病[1-2]，臨床特征表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙、死胎、流產(chǎn)，以及各年齡段豬嚴(yán)重呼吸道癥狀[3-4]。該病于1987年首次在北美被發(fā)現(xiàn)[5]，我國于1996年首次從疑似PRRSV感染的豬群中分離出PRRSV[6]。20多年來，國內(nèi)外學(xué)者對PRRSV的分子流行病學(xué)、病毒復(fù)制機制、致病和免疫應(yīng)答機制進(jìn)行了大量的研究，也開發(fā)出了一系列的防控疫苗，但由于PRRSV獨特而復(fù)雜的免疫和致病機制，已開發(fā)的疫苗仍存在低效、不安全等諸多問題，距完全控制該病還相距甚遠(yuǎn)[7]。目前，PRRS在世界范圍內(nèi)仍呈蔓延之勢，每次暴發(fā)都會給養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟損失[8]。病毒特異性單克隆抗體是研究病毒免疫機制，特別是體液免疫識別機制的基本工具，也是開發(fā)和診斷檢測試劑的必需材料。制備病毒的單克隆抗體需要經(jīng)過抗原純化、小鼠免疫、細(xì)胞融合、單抗篩選、鑒定等重要步驟。其中，單抗篩選是指用病毒抗原來識別鑒定混合在大量雜交瘤細(xì)胞中少數(shù)能夠分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的過程。建立準(zhǔn)確、簡單、快速的高通量病毒單克隆抗體篩選方法，在細(xì)胞融合后用于短時間內(nèi)數(shù)百至數(shù)千個培養(yǎng)上清樣品的篩選，是制備病毒單克隆抗體的關(guān)鍵技術(shù)。PRRSV具有高變異性[9-10]，分為基因1型和2型，其特異性單克隆抗體的制備可以用于區(qū)分2個基因型的毒株[11]。此外，PRRSV是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目(Nidovirales)動脈炎病毒科(Arteriviridae)動脈炎病毒屬(Arterivirus)。PRRSV的基因組中含有10個開放閱讀框，分別編碼14個非結(jié)構(gòu)蛋白和8個結(jié)構(gòu)蛋白，其中GP5、M和N蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白[12-13]，M蛋白和N蛋白較保守，N蛋白在病毒粒子中含量最高[14]。國內(nèi)外學(xué)者分別采用不同方法制備了針對PRRSV病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的單抗[15-16]。國內(nèi)研究者對PRRSV病毒單克隆抗體的篩選多采用經(jīng)典的酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，但由于聚苯乙烯96孔板只能夠強力吸附可溶性蛋白而對顆粒病毒的吸附能力較差[17-18]，所以使用包被病毒進(jìn)行單克隆抗體篩選時，常常出現(xiàn)目的抗體漏篩、非特異性抗體誤判或篩選完全失敗的結(jié)果。免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(Immunoperoxidase monolayer assay，IPMA)常用于細(xì)胞蛋白質(zhì)變化分析及畜禽體液免疫應(yīng)答抗體的檢測[19-22]，也較多用于單克隆抗體篩選后的鑒定[23-25]，而使用IPMA法進(jìn)行抗病毒單克隆抗體的初次篩選已有報道[26-27]，但缺乏技術(shù)細(xì)節(jié)。本研究對IPMA反應(yīng)板的PRRSV感染量、感染時間、PRRSV感染細(xì)胞固定于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的條件等試驗細(xì)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，以建立特異性強、敏感性高且適合高通量篩選病毒單抗的方法，并篩選出高特異性、高敏感性的抗PRRSV的單克隆抗體，建立詳細(xì)完整的IPMA篩選病毒單克隆抗體的方法，為其他動物疫病病毒單克隆抗體制備和篩選提供借鑒。

1 材料和方法

本研究于2016-2018年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室完成。

1.1 病毒和細(xì)胞

PRRSV高致病毒株HN07-1、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)和傳代細(xì)胞Marc-145、PK-15、Vero細(xì)胞均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室保存，PRRSV經(jīng)典毒株BJ-4由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)楊漢春教授惠贈，豬流行性腹瀉病毒(PEDV)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)王川慶教授惠贈，豬肺泡巨噬細(xì)胞系CRL-2843-CD163細(xì)胞株由西北農(nóng)林科技大學(xué)周恩民教授惠贈。

1.2 試驗試劑

胎牛血清、液體培養(yǎng)基1640、DMEM購自GIBCO；豬抗PRRSV陽性血清由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫學(xué)重點實驗室自制；山羊抗豬IgG-HRP和山羊抗鼠IgG-HRP購自Abbkine。

1.3 試驗儀器

生物安全柜、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo fisher)；倒置光學(xué)顯微鏡(德國Leica)；實驗超凈工作臺；37 ℃普通溫箱；酶標(biāo)儀及洗板機(TECAN)；96孔細(xì)胞板；移液加樣器。

1.4 Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)和PRRSV感染增殖

將PRRSV病毒HN07-1接種Marc-145細(xì)胞，設(shè)未接毒細(xì)胞為對照，于37 ℃ 5% CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別在12，24，36，48，60，72 h時連續(xù)觀察細(xì)胞的狀態(tài)，并無菌收集病毒培養(yǎng)上清，于-70 ℃保存。

1.5 PRRSV的IPMA效價測定

制備5×104個/mL的Marc-145細(xì)胞懸液，以每孔100 μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞的覆蓋度達(dá)到85%時，將1.4中6個時間點收集的待測病毒以10倍倍比梯度稀釋至10-6，每個稀釋度做2孔重復(fù)(結(jié)果取平均值)，12 h后棄除培養(yǎng)上清；每孔用100 μL甲醇(含3% H2O2)于37 ℃固定細(xì)胞10 min，棄除固定液；每孔用200 μL含5%脫脂乳的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)于常溫下封閉1 h，棄除封閉液；每孔加入1∶200稀釋抗PRRSV的豬陽性血清100 μL，于37 ℃孵育30 min；用PBST洗板3次，每孔加入1∶500稀釋的羊抗豬IgG-HRP 100 μL，于37 ℃孵育30 min，PBST洗板3次；最后加入AEC底物顯色5 min，用蒸餾水終止顯色，在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察感染PRRSV病毒的Marc-145細(xì)胞的染色情況。觀察順序為從較多染色孔開始觀察到最少染色孔，即從高濃度病毒感染孔到低濃病毒感染度孔，并將最后2個孔細(xì)胞染色數(shù)量≤10的病毒平均稀釋度倒數(shù)作為各時間點PRRSV病毒上清的IPMA效價。

1.6 IPMA反應(yīng)板的制備

根據(jù)1.5的結(jié)果，選用每孔能夠感染約100個細(xì)胞的PRRSV病毒稀釋度(用于IPMA的PRRSV病毒效價的前一個稀釋度)接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的單層Marc-145細(xì)胞來制備IPMA反應(yīng)板，其中保留2個孔(G12和H12)不接種病毒，將其設(shè)為對照，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育12 h后棄除培養(yǎng)上清，然后用甲醇固定細(xì)胞10 min后棄除固定液，每孔再用200 μL含5%脫脂乳的PBST于常溫下封閉1 h，備用。

1.7 IPMA法篩選PRRSV單克隆抗體

融合后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)10 d后開始篩選。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)上清以每孔100 μL轉(zhuǎn)移至制備好的IPMA反應(yīng)板中，并設(shè)置陽性試驗孔和陰性對照孔，在孔E12和G12中加入1∶600稀釋的PRRSV免疫鼠陽性血清(或1∶200稀釋的豬PRRSV陽性血清)，在孔F12和H12中加入1∶600稀釋的PRRSV陰性鼠血清，于37 ℃孵育30 min后用PBST洗板3次，再于每孔加入1∶500稀釋的羊抗鼠IgG-HRP(或1∶500稀釋的羊抗豬IgG-HRP)100 μL，于37 ℃孵育30 min后用PBST洗板3次，最后加入AEC底物顯色5 min，蒸餾水終止顯色，最后顯微鏡下分析染色。顯微鏡下首先觀察設(shè)置的試驗對照孔，然后掃描分析每個檢測孔，根據(jù)感染細(xì)胞的特異性染色判定單克隆抗體。

1.8 PRRSV單克隆抗體的穩(wěn)定性試驗

將PRRSV單克隆抗體陽性孔的培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，取培養(yǎng)24，48，72 h時的培養(yǎng)基上清，重復(fù)篩選試驗。

1.9 PRRSV單克隆抗體的交叉反應(yīng)試驗

將5×104個/mL的CRL-2843-CD163細(xì)胞、PK-15細(xì)胞和Vero細(xì)胞懸液分別鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。PRRSV的HN07-1和BJ-4毒株分別接種于CRL-2843-CD163細(xì)胞，CSFV、PRV分別接種于PK-15細(xì)胞，PEDV接種于Vero細(xì)胞，每種病毒量為每孔能感染100個細(xì)胞左右，留未感染的正常細(xì)胞為對照。檢測抗體上清(一抗)，以各對應(yīng)病毒株的豬陽性血清或特異性單克隆抗體為一抗陽性對照，二抗為山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗豬IgG-HRP，最后加入AEC底物顯色。

1.10 PRRSV的HN07-1毒株單克隆抗體免疫印跡試驗

將經(jīng)Sepharose 4 Fast Flow提純的PRRSV(HN07-1毒株)進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)試驗。

1.11 單克隆抗體與PRRSV重組N蛋白ELISA試驗

用得到的10 μg/mL重組N蛋白(試驗)和pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌蛋白(對照)包被ELISA板，試驗孔和對照孔分別用豬PRRSV陽性血清和豬PRRSV陰性血清，二抗為山羊抗鼠IgG-HRP和山羊抗豬IgG-HRP，最后加入TMB進(jìn)行底物顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同PRRSV感染時間Marc-145細(xì)胞的狀態(tài)和上清中的病毒增殖效價

PRRSV感染Marc-145細(xì)胞12 h時，Marc-145細(xì)胞狀態(tài)仍然處于最佳時期，PRRSV尚在胞漿中進(jìn)行復(fù)制，IPMA效價檢測結(jié)果表明，此時PRRSV尚沒有釋放至培養(yǎng)基中，是進(jìn)行IPMA試驗的最佳時間。但隨著感染時間延長，PRRSV快速分裂繁殖，出現(xiàn)細(xì)胞融合病變(CPE)使Marc-145細(xì)胞死亡脫落離壁(表1)。

表1 不同PRRSV感染時間對Marc-145細(xì)胞狀態(tài)的影響Tab.1 The effect of PRRSV infection time on Marc-145 cell culture

不同時間段收集的PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的培養(yǎng)上清做10倍遞增稀釋接種細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞染色孔數(shù)量與IPMA效價成正相關(guān)。將PRRSV感染12 h時收集的Marc-145細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行10倍稀釋接種細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，沒有細(xì)胞染色，無IPMA效價。當(dāng)PRRSV感染24，36，48 h時，Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)上清中病毒效價較高。當(dāng)PRRSV感染60 h和72 h時，隨著Marc-145細(xì)胞受損嚴(yán)重(CPE++++)，病毒效價開始明顯下降(圖1)。因此，篩選PRRSV單克隆抗體制備IPMA板時應(yīng)選用PRRSV感染24～48 h的Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)上清，病毒接種量為效價的前一個稀釋度。

圖1 不同PRRSV感染時間上清中病毒的IPMA效價(lg)Fig.1 The IPMA titers of PRRSV culture supernatant in different infected time

2.2 IPMA的篩選時間、反應(yīng)條件和PRRSV單克隆抗體染色的鑒別判定及處理依據(jù)

以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中雜交瘤細(xì)胞融合后的10 d時檢測培養(yǎng)上清最佳，此時高敏感性單克隆抗體(僅占孔底面積1/20)即可被檢出。從顯微鏡中觀察IPMA染色，判定篩選的單克隆抗體結(jié)果：首先觀察所設(shè)的試驗對照孔(PRRSV抗體陽性及陰性血清孔)染色，試驗的陽性孔的細(xì)胞胞漿被染色，多抗常伴有非特異著染(圖2-A-B)，試驗的陰性孔的細(xì)胞未被染色(圖2-C)，陽性和陰性血清顯色結(jié)果正確說明試驗可靠。然后觀察檢測孔的染色，檢測孔中有100個左右的細(xì)胞胞漿清晰染色(無任何其他背景著染)，判定為細(xì)胞上清分泌PRRSV特異性單克隆抗體(圖2-D)，要格外注意篩到的分泌特異性單抗的細(xì)胞，注意培養(yǎng)和凍存，避免污染而檢測孔中無細(xì)胞染色或細(xì)胞普遍染色的是無抗體分泌和非特異性抗體反應(yīng)(圖2-D-F)，可棄之。

A.PRRSV免疫小鼠的陽性血清；B.豬PRRSV陽性血清；C.PRRSV陰性鼠血清；D.PRRSV特異性單克隆抗體；E-F.非特異性Abs。A.Serum of PRRSV immunized mice; B.Porcine PRRSV positive serum; C.PRRSV negative mouse serum; D.PRRSV specific mAb; E-F.Nonspecific Abs.

2.3 PRRSV單克隆抗體穩(wěn)定性和特異性

將PRRSV單克隆抗體孔的培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h后，再收集細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)反應(yīng)穩(wěn)定。將篩選到的含有PRRSV單克隆抗體(39份)的上清分別與CSFV、PRV、PEDV感染細(xì)胞進(jìn)行IMPA檢測發(fā)現(xiàn)，所有單克隆抗體僅和PRRSV感染的CRL-2843-CD163細(xì)胞產(chǎn)生染色反應(yīng)，與其他病毒株的感染無交叉反應(yīng)(表2)，表明篩選的PRRSV單克隆抗體特異性良好。

2.4 PRRSV單克隆抗體的Western Blotting結(jié)果

通過Western Blotting對篩選的PRRSV單克隆抗體進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，39份PRRSV單克隆抗體中有26份能與PRRSV的HN07-1毒株的N蛋白條帶產(chǎn)生良好顯色，如單抗1D1(圖3)。

表2 IPMA交叉反應(yīng)試驗結(jié)果Tab.2 The cross reactivity of the IPAM assay

注：+.感染細(xì)胞染色；-.無細(xì)胞染色。

Note：+.Staining；-.No staining.

圖3 PRRSV單克隆抗體1D1的Western BlottingFig.3 Western Blotting result with PRRSV mAb 1D1

2.5 PRRSV單克隆抗體與重組N蛋白的ELISA結(jié)果

利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所制備的重組N蛋白包被ELISA板后對PRRSV單克隆抗體進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，1D1、7G8等27份單克隆抗體能與重組N蛋白產(chǎn)生良好反應(yīng)，OD值在0.981～1.329(表3)；6E7、7F12等15份單克隆抗體不能與重組N蛋白發(fā)生反應(yīng)，OD值在0.043～0.050(表3)。

表3 PRRSV單克隆抗體與重組N蛋白包被的ELISA結(jié)果(OD450)Tab.3 The reactivity of the mAbs with PRRSV N protein by ELISA(OD450)

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞成功融合后，雜交瘤細(xì)胞樣品數(shù)量巨大(108個B細(xì)胞和5×107個骨髓瘤細(xì)胞融合后分散在10～40塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，共有960～3 840個樣品)，因此建立快速準(zhǔn)確的高通量篩選方法是制備PRRSV單克隆抗體的關(guān)鍵。此前，國內(nèi)外學(xué)者曾經(jīng)采用ELISA方法篩選鑒定單抗[28-29]。前期研究中也曾多次使用同樣的方法進(jìn)行病毒包被建立ELISA方法并用于PRRSV單克隆抗體的篩選，盡管病毒純化、小鼠免疫和細(xì)胞融合過程均取得成功，但難以篩選出敏感性高、特異性強的PRRSV單克隆抗體。分析原因可能是由于聚苯乙烯96孔板不能牢固吸附完整的顆粒病毒，在反應(yīng)過程中多次洗滌會造成病毒顆粒脫落，從而導(dǎo)致PRRSV單克隆抗體篩選的失敗。用IPMA方法篩選PRRSV單克隆抗體時，PRRSV病毒可通過感染細(xì)胞進(jìn)行增殖并被固定在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上從而直接捕獲PRRSV單克隆抗體，所獲得的PRRSV單克隆抗體具有高度特異性。Yoon等[30]和Liang等[31]的報道中，對病毒的單克隆抗體進(jìn)行篩選的試驗中IPMA比ELISA的免疫反應(yīng)更敏感、準(zhǔn)確，這與本研究的結(jié)果一致。

應(yīng)用IPMA法篩選抗病毒的單克隆抗體時特別要注意做好以下幾點：①細(xì)胞單層，接種病毒時用覆蓋度為80%～85%對數(shù)生長期的單層細(xì)胞，以利于病毒的快速分裂和繁殖，感染的單層細(xì)胞在培養(yǎng)12～15 h時狀態(tài)最好，此時固定并進(jìn)行后續(xù)試驗，染色后的結(jié)果最佳；②定量接種病毒，以每孔能夠感染100個細(xì)胞的PRRSV病毒量最佳，若接種的病毒過多，細(xì)胞感染率過高或全部感染均不易區(qū)分，而病毒接種太少則容易漏篩；③細(xì)胞固定時間，當(dāng)病毒感染細(xì)胞后，一定時間內(nèi)病毒于胞漿進(jìn)行復(fù)制，選擇病毒未大量釋放胞外前的時間進(jìn)行細(xì)胞固定，例如對于PRRSV的HN07-1毒株來說，于感染細(xì)胞12～15 h時對細(xì)胞進(jìn)行固定最佳；④選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞固定劑，合適的細(xì)胞固定劑能夠讓細(xì)胞更具通透性，有利于抗體與病毒的接觸；⑤單克隆抗體開始篩選的時間，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞融合后繼續(xù)生長10 d左右，此時雜交瘤細(xì)胞的覆蓋度達(dá)到16.7%以上，開始進(jìn)行篩檢最佳；⑥篩選對照的設(shè)置，試驗中應(yīng)設(shè)置抗體的陽性對照和陰性對照，對已篩出的單克隆抗體進(jìn)行重復(fù)IPMA篩選時還應(yīng)設(shè)置正常細(xì)胞對照。

本研究將定量感染復(fù)制在Marc-145細(xì)胞內(nèi)的PRRSV固定在含有單層細(xì)胞的96孔IPMA板上，從而精準(zhǔn)篩選出融合后的雜交瘤細(xì)胞所分泌的抗PRRSV單克隆抗體，39份含有PRRSV單克隆抗體的上清經(jīng)過交叉反應(yīng)試驗、Western Blotting和重組N蛋白的ELISA試驗后，證實所篩選到的PRRSV單克隆抗體具備高度特異性和敏感性。本研究所得的IPMA法既適用于PRRSV單克隆抗體制備中的樣品初篩和鑒定，也適用于對PRRSV單克隆抗體的特異性鑒定。