黃 凱,林亞秋,朱江江,馬潔瓊,王 永

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用四川省重點實驗室，四川 成都 610041)

肌肉是動物運動系統(tǒng)的組成器官，肌纖維是肌肉的最基本單位，它的數(shù)量和類型直接影響動物肉產(chǎn)品品質[1]，進而影響動物的經(jīng)濟效益。肌肉最終形成需要經(jīng)歷成肌細胞分化、遷移和增殖以及肌管形成幾個階段[2]，在這樣一個復雜的發(fā)育過程中，各種因素相互調節(jié)，其中與肌肉發(fā)育相關的基因發(fā)揮非常重要的作用[3]。成肌細胞調控因子家族MyoD(Myogenic differentiation antigen)是目前研究較為透徹的肌肉發(fā)育相關基因，但肌肉的生長發(fā)育應該是很多基因共同調控的結果，不只是單個基因發(fā)揮作用，因此篩選影響肌肉生長發(fā)育相關基因尤為重要。

成纖維細胞生長因子家族(Fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)已發(fā)現(xiàn)有23個成員[4-6]，它們之間有20%～50%高度同源的氨基酸序列，且分子質量在20～35 ku。FGFs是由垂體和下丘腦經(jīng)旁分泌或自分泌產(chǎn)生的多肽，它能促進細胞遷移、增殖和分化，使胚胎發(fā)育、腫瘤形成，對損傷組織的修復也有較大作用[7-8]。FGF9是成纖維細胞生長因子家族中的重要成員之一，最早在人類神經(jīng)膠質瘤細胞中分離得到[9]，編碼208個氨基酸，所具有的三葉草核心結構需要與肝素結合激活受體來發(fā)揮作用，受體通常為FGFR2和FGFR3。研究發(fā)現(xiàn)FGF9mRNA在人體各組織中廣泛表達，尤其是在腦、腎、子宮和骨組織中，但FGF9蛋白在正常生理條件下以相對低的水平表達。FGF9可以促進上皮細胞、神經(jīng)膠質細胞和成纖維細胞等的增殖，對胚胎期生殖系統(tǒng)和肺組織的發(fā)育也有重要作用[10]。此外，F(xiàn)GF9敲除小鼠出生后死于肺細胞缺氧，并表現(xiàn)出各種異?，F(xiàn)象，如睪丸發(fā)育不全和男女性別逆轉[11]。FGF9的異常表達還與幾種人類癌癥如子宮內膜癌[12]和子宮內膜異位癥有關。這些研究提示必須嚴格控制FGF9的表達以維持機體內平衡。綜上所述，目前關于FGF9的研究主要集中在性別決定、骨骼發(fā)育與損傷修復、卵巢癌腫瘤等方面[13-16]。尚未見FGF9在山羊中的報道，其是否與山羊肌肉生長有關，是否可作為肌肉生長的關鍵調控基因還有待進一步地研究。

本試驗以生長速度快、肉質特性好的簡州大耳羊為研究對象，采用RT-PCR技術克隆獲得FGF9基因序列，然后利用實時熒光定量PCR技術分析組織表達特性，構建該基因的組織表達譜，同時檢測其在山羊成肌細胞分化過程中的表達模式，旨在為后續(xù)研究FGF9基因在山羊成肌細胞分化中的調控作用提供重要數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物及取材 在四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司挑選6只健康的1周歲簡州大耳羊公羊，將其空腹頸動脈放血致死，無菌采集各山羊心、肝、脾、肺、腎、小腸、瘤胃、皮下脂肪和背最長肌等組織，用0.1% DEPC水沖洗干凈裹上錫箔紙裝入凍存管，迅速放入液氮內帶回實驗室用于提取組織總 RNA。山羊成肌細胞則由實驗室前期試驗分離得到，并凍存于液氮罐內備用。

1.1.2 主要試劑 TRIzol試劑、pMD-19T載體、熒光定量試劑盒(TaKaRa公司，大連)；DNA 聚合酶、總RNA提取試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α(天根生化科技有限公司，北京)；反轉錄試劑盒(Thermo公司，美國)；膠回收試劑盒(Axygen公司，美國)；DEPC、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、油酸(Sigma公司，美國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 山羊FGF9基因的克隆測序 根據(jù)GenBank公布的山羊FGF9基因預測序列(登錄號為XM_005687564.3)在Primer Premier 5.0軟件上設計PCR引物(表1)。研磨成年羊肺組織樣品，用TRIzol法提取總RNA，電泳檢測正確并用紫外分光光度計測得總RNA的OD值在1.8～2.0，符合試驗要求。參照反轉錄試劑盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)說明書，按2 μg反轉錄獲得cDNA。PCR反應體系：DNA聚合酶12.5 μL、模板cDNA 1.0 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、ddH2O 9.5 μL。 PCR程序設定：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，做膠回收再連接pMD-19T 載體，轉化感受態(tài)細胞DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆經(jīng)菌液PCR鑒定正確后送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.2.2FGF9基因序列分析 測序結果在NCBI的Blast上比對序列同源性，用MEGA 5.0 繪制系統(tǒng)進化樹，應用ExPASy分析蛋白質的基本理化性質，利用Signal P 4.1 分析信號肽序列，通過TMHMM 2.0預測蛋白跨膜結構域，使用Net Phos 3.1預測FGF9蛋白磷酸化位點，采用Hopfield和PHYRE2 Server工具進行二級結構和三級結構預測。

1.2.3FGF9基因組織表達譜的構建 用TRIzol法提取成年羊(6只)心、肝、脾、肺、腎、小腸、瘤胃、皮下脂肪和背最長肌等組織總RNA，反轉錄得到cDNA。根據(jù)1.2.1中克隆的FGF9基因序列與NCBI公布的山羊磷酸三丁酯(Tributyl phosphate，TBP)序列(登錄號為XM_018053502.1)，在Primer Premier 5.0 軟件上分別設計特異性引物(表1)。采用實時熒光定量 PCR(qPCR)檢測FGF9mRNA在簡州大耳羊各組織中的表達水平，構建其組織表達譜。qPCR反應體系：SYBR ?Premix ExTaqTM(2×) PCR 10 μL，模板cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，ddH2O 7 μL。程序設定：95 ℃預變性 3 min；95 ℃ 10 s，66 ℃ 10 s，72 ℃延伸15 s，39個循環(huán)。

1.2.4 山羊成肌細胞的復蘇 取山羊脂肪代謝實驗室前期凍存的山羊成肌細胞，迅速置于37 ℃水浴鍋內振蕩解凍。待細胞復蘇后轉入100 mm培養(yǎng)皿，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代。

1.2.5FGF9基因在山羊成肌細胞分化中的表達差異 成肌細胞傳至第3代且有90% 的細胞發(fā)生融合時，用終濃度100 μmol/L的油酸誘導完全培養(yǎng)基中的細胞進行分化，收集分化0.0，0.5，1.0，2.0，4.0 d的肌肉細胞，參照細胞RNA提取試劑盒說明書提取細胞中總RNA，再用RNA反轉錄試劑盒按1 μg將其反轉錄為cDNA。根據(jù)NCBI公布的山羊18SrRNA基因序列(登錄號為DQ149973.1)，在Primer Premier 5.0 軟件上設計特異性引物(表1)。利用qPCR技術，對不同分化天數(shù)的肌肉細胞中FGF9基因表達量進行檢測，qPCR反應體系及條件同1.2.3。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 定量數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法計算，其中ΔΔCt=(CtFGF9-CtTBP)試驗組-(CtFGF9-CtTBP)對照組，計算結果在SPSS 18.0中進行單因素方差分析和顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。試驗數(shù)據(jù)均用“平均值±標準差(X±SD)”表示。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

注：S.正義鏈引物; A.反義鏈引物; TBP.磷酸三丁酯。

Note：S.Sense primer; A.Antisense primer;TBP.Tributyl phosphate.

2 結果與分析

2.1 山羊FGF9基因克隆及同源性分析

經(jīng)克隆測序得到1條長818 bp的FGF9基因序列，包括627 bp的編碼區(qū)，編碼了208個氨基酸(圖1)，另有88 bp的 5′UTR序列和103 bp的3′UTR序列，上傳全長序列到NCBI獲得GenBank登錄號：MH358358。同源性分析表明，山羊FGF9基因的CDS區(qū)序列與綿羊(XM_004012161.3)、牛(NM001245926.1)和獐鹿(HG326981.1)的同源性高達99%，與豬(AK343298.1)、大鼠(NM_012952.1)的同源性達91%，與小鼠(HM988990.1)和人(NM_002010.2)的同源性為90%。構建的系統(tǒng)進化樹(圖2)顯示，山羊FGF9基因序列在各物種進化上是高度保守的，尤其與綿羊親緣關系最近。

2.2 FGF9基因生物信息學分析

蛋白質理化性質分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF9蛋白理論分子質量為23.38 ku，等電點為7.06，屬于不穩(wěn)定親水蛋白。利用Signal P 4.1 Server預測FGF9 蛋白的信號肽序列(圖3)，發(fā)現(xiàn)其中并不存在信號肽序列。利用SMART軟件預測蛋白結構域，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有1個跨膜結構域，跨膜結構在第17-33個氨基酸殘基，還有1個從第60-190個氨基酸殘基的FGF特有結構域。磷酸化位點對蛋白質功能具有重要作用，運用 Net Phos 3.1 軟件對FGF9 蛋白可能的磷酸化位點進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有6個酪氨酸、7個蘇氨酸和8個絲氨酸磷酸化位點(圖4)，第625個氨基酸殘基處還有1個O-糖基化位點，但無N-糖基化位點。

起始密碼子用方框表示；跨膜結構域(AA17-33)下劃黑色雙線；陰影部分(AA60-190)為FGF家族同源性結構域；*表示終止密碼子。The start codon (ATG) is represented by the box；Transmembrane spaning domain(AA17-33)is under black double line；FGFs homologous domain is indicated as shaded residues(AA60-190)；*Represents the stop codon.

圖2 采用MEGA 5.0構建山羊FGF9序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree was constructed based on FGF9 sequence using MEGA 5.0

圖3 山羊FGF9蛋白的信號肽分析Fig.3 Signal peptide analysis of goat FGF9 protein

二級結構預測顯示FGF9蛋白主要有3種存在形式，包括66.35% 的無規(guī)卷曲(c)，17.31% 的β-折疊(e)和16.35% 的α-螺旋(h)。并且用PHYRE2 Server(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi? id=index)分析了該蛋白的三級結構(圖5)。利用STRING數(shù)據(jù)庫搜索到GRB2、MAPK3、FGFR3等蛋白可能和FGF9蛋白存在相互作用(圖6)。采用PSORT Ⅱ進行亞細胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要在線粒體(30.4%)、細胞質(30.4%)和高爾基體(13.0%)中發(fā)揮生物學作用。

圖4 山羊FGF9序列的磷酸化位點預測Fig.4 Predicted phosphorylation site in FGF9 sequence

圖5 山羊FGF9蛋白三級結構預測Fig.5 Tertiary structure prediction of goat FGF9 protein

圖6 與山羊FGF9蛋白相互作用蛋白預測Fig.6 Prediction of proteins interacting with goat FGF9 protein

2.3 山羊FGF9基因組織表達譜的構建

以TBP為內參基因，用qPCR技術檢測FGF9基因的組織表達情況，根據(jù)在山羊不同組織的表達差異構建組織表達譜。結果發(fā)現(xiàn)在心、肝、脾、肺、腎、小腸、瘤胃、皮下脂肪和背最長肌中均檢測到FGF9的表達，但表達程度不同，腎臟中的相對表達量最高，且極顯著高于其他被測組織(P<0.01)，小腸組織次之，肝臟和脾臟最低(圖7)。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。Different capital letter indicate extremely significant differences(P<0.01).

2.4 FGF9基因在山羊成肌細胞分化中的表達差異

以18SrRNA為內參基因，采用qPCR技術檢測FGF9基因在山羊成肌細胞不同分化階段的表達情況(以0 d的表達水平為對照)(圖8)，結果發(fā)現(xiàn)FGF9基因在成肌細胞誘導分化第2天表達水平顯著高于分化前(P<0.05)，且在第4天達到極顯著水平(P<0.01)。

3 結論與討論

FGF9作為成纖維細胞生長因子家族(FGFs)成員之一，是參與許多生理過程的有效促分裂劑，它能刺激中胚層和神經(jīng)外胚層細胞生長，促進分化[17]。近年來，有關FGF9的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)FGF9活化FGFR2、FGFR3可以促進成骨細胞生長，提高骨密度[18-19]，揭示FGF/FGFR信號傳導是維持成體骨穩(wěn)態(tài)的重要途徑。先天性缺乏FGF9可導致顯著的骨骼軟骨發(fā)育不良，同時發(fā)現(xiàn)在顱面骨、椎骨和肋骨中還有其他的缺陷，但是給予體外培養(yǎng)的小鼠顱骨FGF9后，發(fā)現(xiàn)顱縫愈合、骨細胞分化增強[20]。這說明在骨骼發(fā)育中，F(xiàn)GF9可以促進軟骨內骨化和膜內成骨。FGF9還可以直接調節(jié)骨代謝，裴育等[21]發(fā)現(xiàn)FGF9通過MAPK信號通路抑制小鼠MA3T3-E1和C2C12細胞中Cbfa1基因的啟動子活性和mRNA水平，推測可能有其他FGF家族成員與FGF9形成互補，共同調節(jié)成骨細胞分化。Frontini等[22]報道，F(xiàn)GF9通過SHH和血小板源性生長因子受體β(PDGFRβ) 在刺激平滑肌細胞形成微管的過程中發(fā)揮關鍵作用。但FGF9在山羊肌肉生長中的作用，及其在成肌細胞分化中的研究還尚未見報道。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different capital letter indicate extremely significant differences(P<0.01)；Different lowercases indicate significant differences (P<0.05).

本試驗克隆獲得山羊FGF9基因序列818 bp，其中CDS區(qū)627 bp，編碼208個氨基酸，與NCBI上公布的綿羊、牛、獐鹿、豬、大鼠、小鼠和人的CDS區(qū)序列分別有99%，99%，99%，91%，91%，90%，90%的同源性，表明FGF9在不同種屬間有著較高的同源性。通過蛋白結構域預測，發(fā)現(xiàn)FGF9蛋白具有1個跨膜結構域和1個FGF同源結構域[23]。但是信號肽預測結果顯示，在FGF9蛋白中不存在信號肽序列，有文獻稱FGF9 N端的35個氨基酸作為非剪切信號肽可以替代經(jīng)典的信號肽，使FGF9同其他分泌蛋白一樣分泌到胞外[24]。相互作用蛋白分析則顯示該蛋白可能和GRB2、MAPK3、FGFR3等蛋白存在相互作用。

本試驗利用qPCR技術進一步研究了FGF9mRNA在1周歲山羊體內的表達情況，根據(jù)組織表達譜分析，發(fā)現(xiàn)該基因在體內各組織中廣泛表達，在腎臟中表達量最高，極顯著高于其他組織，其次是小腸，表達最低的是肝臟和脾臟。在牛和小鼠的研究中也同樣證明了FGF9基因具有在各組織中廣泛表達的特點[17,25]。陳曉怡等[26]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF9在小鼠心、肝、肺、腎、大腦、小腦、骨骼肌等12種組織中均有表達，且在心、腎、小腦和骨骼肌中高表達，在大腦和關節(jié)中表達較弱。這些報道與本試驗結果存在相似及不同之處。

前人在研究FGF家族時，比較過其他幾個分泌型FGFs，發(fā)現(xiàn)FGF4、FGF5、FGF6在骨骼肌成肌細胞亞群中以肌管形成的形式表達[27-29]，而FGF9則以另一種不同的時空模式在小鼠成肌細胞中表達，在E9.5和E10.5的肌節(jié)中檢測到FGF9mRNA的表達，在E12.5中通過比較FGF9和α-心肌肌動蛋白探針雜交相鄰部分，證明了FGF9在E12.5的小鼠頭部和軀干的大部分乃至全部骨骼肌成肌細胞中表達[30]。在本試驗中，檢測了FGF9在山羊成肌細胞不同分化階段的表達水平，發(fā)現(xiàn)該基因在成肌細胞誘導分化第2天表達水平顯著高于分化前(P<0.05)，且在第4天達到極顯著水平(P<0.01)，由此推測其可能參與山羊肌肉組織的生長。

本研究成功克隆山羊FGF9基因，序列長818 bp，其中CDS區(qū)627 bp，編碼208個氨基酸。獲得GenBank登錄號：MH358358。FGF9基因在山羊心、肝、脾、肺、腎、小腸、瘤胃、皮下脂肪和背最長肌等組織中存在廣泛表達，且在腎臟組織中存在較高水平表達。FGF9在成肌細胞誘導分化第2天表達水平顯著高于分化前，且在第4天達到極顯著水平，推測其可能作為調控山羊成肌細胞分化的候選基因。本研究為進一步探究FGF9基因在山羊肌肉生長中的作用提供基礎數(shù)據(jù)。