任慶源, 何武林, 王慶, 林海燕
南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院、廣東省口腔醫(yī)院正畸科(廣東廣州 510280)
隨著錯頜畸形的設(shè)計和矯治理念的改進(jìn)以及高性能矯治系統(tǒng)的發(fā)展,正畸學(xué)者的研究熱點逐漸轉(zhuǎn)向牙周膜細(xì)胞對正畸力的生物反應(yīng)。從牙周骨改建過程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子進(jìn)行深入研究,不僅能為探明牙周病患者被施加正畸矯治力后牙周改建的分子生物學(xué)機制,以便科學(xué)有效地針對性矯治、提高矯治效果、促進(jìn)牙齒健康可控的移動提供線索和理論依據(jù),從而實現(xiàn)小范圍牙移動,它是當(dāng)代正畸治療生物學(xué)概念創(chuàng)新所需的理論基礎(chǔ)[1]。有學(xué)者[2-6]發(fā)現(xiàn)在心血管、腎臟等組織器官內(nèi)以及軟骨細(xì)胞增殖分化過程中,轉(zhuǎn)錄激活因子4(transcription activation factor 4,ATF4)表達(dá)的機械上調(diào)涉及蛋白激酶受體樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase receptorlike ER kinase,PERK),有研究表明[7-8],內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)出現(xiàn)在成骨細(xì)胞分化過程中,表明 PERK-eIF2α-ATF4通路可能與 ERS介導(dǎo)的骨形成或成骨分化有關(guān),由此推測正畸力作用于牙周膜刺激 ATF4高表達(dá)的過程中也可能有 PERK參與,然而,國內(nèi)外很少報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的 PERK-eIF2α-ATF4信號通路對正畸牙移動過程中牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響。2017年6月至2018年6月本實驗擬通過深入研究明確人牙周膜細(xì)胞(HPDLCs)受到正畸機械力刺激后 ATF4表達(dá)的相關(guān)具體機制,以及 PERK與 ATF4間的關(guān)系。
1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用酶消化組織塊法提取 HPDLCs,培養(yǎng)標(biāo)本來自于南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院由于需要正畸而拔除的第一或第二前磨牙的患者?;颊呒凹覍倬阎橥狻K醒例X都在無菌條件下拔除,沒有齲壞、根尖周炎和牙周炎,患者年齡13~18歲。在拔牙前患者用漱口水漱口,然后用1%碘酊和酒精進(jìn)行局部消毒。拔除后的牙齒立即在無菌條件下裝入含高濃度雙抗的PBS的15 mL離心管中,并于30 min內(nèi)對標(biāo)本進(jìn)行處理培養(yǎng)。在超凈工作臺(ESCO,Canada)內(nèi)用含有高濃度抗生素(青霉素100 μg/mL,鏈霉素100 μg/mL, Hyclone,USA)的PBS漂洗樣品牙齒2~3次,然后使用鋒利的刀片完全刮除干凈牙根中1/3的牙周韌帶組織。之后將牙周韌帶組織浸入含有終濃度為3 mg/mL 的Ⅰ型膠原酶(Sigma,USA)的α-MEM(Gibco,USA)培養(yǎng)基中。置于37℃水浴箱中消化,每15 min震蕩1次,消化1 h后,加入完全培養(yǎng)基[含10%胎牛血清,1%青霉素100 μ/mL,鏈霉素100 μg/mL]終止消化,800 r/min,5 min離心,棄上清,重懸于完全培養(yǎng)基中,在飽和濕度、5% CO2、950 mL/L空氣的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。直到細(xì)胞在組織塊周圍游動,細(xì)胞傳代達(dá)80%匯合。3~5代細(xì)胞用于加力實驗。
1.2 HPDLCs組織來源鑒定 取第3代HPDLCs經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后,將細(xì)胞以2×104個/mL的密度接種于底面有細(xì)胞爬片的6孔板內(nèi),在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到85%以上,取出細(xì)胞爬片,PBS沖洗3次,4%多聚甲酸固定30 min,PBS沖洗3次后涼干,采用細(xì)胞免疫組化SABC法檢測角蛋白和波形蛋白,封片后觀察。
1.3 HPDLCs加載流體切應(yīng)力 將細(xì)胞密度高于85%的HPDLCs用0.25%胰蛋白酶(Trypsin含0.02%EDTA,Gibco,USA)消化后,以3×105個/片的細(xì)胞密度接種于載玻片,將其置于培養(yǎng)皿中,接種2 h后加入完全培養(yǎng)液,完全浸沒載玻片,繼續(xù)于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天,細(xì)胞密度達(dá)到85%以上準(zhǔn)備進(jìn)行加力。將接種HPDLCs的載玻片隨機分成4組,使用蠕動泵(Coleparmer,USA)向每個實驗組提供12達(dá)因/cm2的流體切應(yīng)力,分別加力0、2、4、6 h,加力0 h為對照組。
1.4 堿性磷酸酶染色檢測成骨分化情況 加載流體切應(yīng)力后的各組載玻片取出,用PBS沖洗2次后,加入10%多聚甲醛固定30 min后,根據(jù)BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說明書對每組細(xì)胞進(jìn)行染色,顯微鏡下觀察染色情況。
1.5 實時定量PCR法檢測基因表達(dá) 加載流體切應(yīng)力后的各組HPDLCs立即使用Trizol試劑(Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, USA)分別提取細(xì)胞總RNA,測定RNA樣品濃度(A260/A280≥1.8);反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,觀察不同時間 PERK、真核翻譯起始因子2A(Eukaryotic translation initiation factor 2A,eIF2A)、ATF4各基因的表達(dá)情況,PCR引物序列見表1。本研究所使用的引物序列由Primer Premier 5.0設(shè)計,由廣州思晉生物工程技術(shù)有限公司合成。取1.0 μL反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA在10 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行實時PCR擴增。以細(xì)胞骨架蛋白β-actin作為內(nèi)參,通過2-ΔΔC(ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-肌動蛋白,ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt對照,Ct為循環(huán)次數(shù))法檢測每種基因mRNA相對表達(dá)水平。每例樣品及陰性對照均設(shè)置3個平行復(fù)孔,取平均值。PCR條件:95℃預(yù)變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火60 s,循環(huán)40次。
表1 PCR使用的引物序列
2.1 人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)及表型鑒定 培養(yǎng)10 d后,原代HPDLCs從組織塊中爬出(圖1),3代HPDLCs(圖2)進(jìn)行免疫組化染色,光鏡下可見細(xì)胞波形絲蛋白(Vimentin)染色陽性,細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色,陽性顆粒均勻分布,細(xì)胞核清晰無染色(圖3),符合中胚層來源的成纖維細(xì)胞特征;細(xì)胞角蛋白(Cytokeratill)染色陰性(圖4),表明無外胚層來源的細(xì)胞。
2.2 堿性磷酸酶染色 人牙周膜細(xì)胞經(jīng)流體切應(yīng)力處理后,其ALP染色呈藍(lán)紫色,顏色較對照組有顯著加深。見圖5。
圖1 原代HPDLCs從組織塊中爬出(×200)
圖23代HPDLCs(×200)
圖3波形絲蛋白(Vimentin)染色陽性,細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色,陽性顆粒分布均勻,胞核清晰無染色(×200)
圖4細(xì)胞角蛋白(Cytokeratill)染色陰性(×200)
A:對照組; B:加力2 h組; C:加力4 h組; D:加力6 h組
2.3 實時定量PCR 經(jīng)流體切應(yīng)力處理后的各組牙周膜細(xì)胞,PERK和ATF4基因的表達(dá)量均高于對照組,在4 h達(dá)到峰值,6 h有所降低(P<0.05),見表1~2、圖6~7。eIF2α基因表達(dá)量均低于對照組,且在4 h時達(dá)到最低值,6 h有所回升(P<0.05),見表4、圖8。
表2PERK實時定量PCR
項目樣本量對照組加力2 h組加力4 h組加力6 h組PERK31.001.36±0.083.25±0.121.74±0.20F值6.12215.91511.700P值0.0000.0000.020
圖6 PERK實時定量PCR
項目樣本量對照組加力2 h組加力4 h組加力6 h組ATF431.0013.89±2.013 424.23±18.46 2 402.22±99.91F值11.56414.44216.00P值0.0000.0000.000
圖7 ATF4實時定量PCR
項目樣本量對照組加力2 h組加力4 h組加力6 h組eIF2A31.000.81±0.110.01±0.030.95±0.04F值12.35816.0000.257P值0.8400.0000.000
圖8 eIF2A實時定量PCR
近些年,越來越多的學(xué)者致力于牙周組織受到機械力后,牙周膜細(xì)胞對于機械力的表現(xiàn),在正常情況下,牙周組織具有一定的自我更新和修復(fù)的能力,主要通過牙周膜細(xì)胞的自我更新來實現(xiàn)[9]。刺激破骨分化的機制很復(fù)雜,受到多種相關(guān)因素的影響,因此,已有不同種類的機械力刺激作用于牙周膜細(xì)胞,體外培養(yǎng)細(xì)胞的加力方式大致可分為:壓力載荷法[10-11]、機械拉伸法[12-13]、流體剪切法[14-15]。Schwarz等[16]認(rèn)為牙周膜組織是一種連續(xù)的液態(tài)環(huán)境,組織液既是細(xì)胞物質(zhì)交換的媒體又是傳遞和緩沖應(yīng)力的介質(zhì),當(dāng)牙齒受力發(fā)生位移時,必然會擠壓牙周膜引起組織液的液壓迅速改變。有學(xué)者認(rèn)為,細(xì)胞對外力的反應(yīng)是因為外力導(dǎo)致組織間液流動改變,從而被細(xì)胞感知,因此細(xì)胞對FSS的反應(yīng)比對壓力及牽張力的反應(yīng)敏感得多[17]。就牙周應(yīng)力環(huán)境而言,體外施加FSS更能模擬整個牙移動時牙周膜所受到的機械力。用于研究HPDLCs在正畸牙移動的整個骨改建過程中的作用,為正畸力作用下骨組織改建的研究提供實驗依據(jù)。
PERK是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)最重要的細(xì)胞器之一,參與各種細(xì)胞信號的處理,其功能的紊亂對于細(xì)胞而言是致死性的。近些年,有關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)在心血管、腎臟等組織器官內(nèi)以及軟骨細(xì)胞增殖分化過程中,機械力上調(diào)ATF4表達(dá)涉及PERK,當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、鈣離子平衡失調(diào)等刺激時,未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積聚,內(nèi)環(huán)境的Ca2+濃度改變,進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的失衡。此時相應(yīng)的信號通路將激活,引發(fā)ERS。大量研究證實,ERS主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3種蛋白——PERK、ATF6、肌醇酶1(inositol requiring enzyme1,Ire1)介導(dǎo),其中PERK的作用涉及PERK-eIF2α-ATF4信號通路。ERS發(fā)生時,大量未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白與Bip(binding immunoglobulin protein)結(jié)合,導(dǎo)致PERK從復(fù)合物中解離出來而被激活,通過跨膜磷酸化而轉(zhuǎn)導(dǎo)ERS反應(yīng)信號,磷酸化的eIF2α不能啟動蛋白質(zhì)的翻譯過程,從而減少蛋白質(zhì)合成,降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白質(zhì)濃度并降低能耗,維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[18-20]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過流體切應(yīng)力作用后的人牙周膜細(xì)胞PERK、ATF4表達(dá)均發(fā)生上調(diào),eIF2α下調(diào),且趨勢有相關(guān)性,且與PERK通路各因子相互調(diào)節(jié)關(guān)系相符,提示PERK-eIF2α-ATF4信號通路介導(dǎo)的ERS參與正畸加力時牙周膜改建過程,并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
正畸牙移動有賴于力刺激下牙周組織和骨組織的改建,其中成骨細(xì)胞在骨形成和破骨細(xì)胞附著分化方面[21]有重要作用。有研究表明,PERK-eIF2α-ATF4信號通路介導(dǎo)的ERS參與成骨細(xì)胞的成骨向分化[20],本研究中,ALP染色結(jié)果顯示經(jīng)過流體切應(yīng)力作用后的牙周膜細(xì)胞成骨作用增強,提示ERS促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的成骨向分化。
綜上所述,機械力能夠激活ERS進(jìn)而激活PERK-eIF2α-ATF4信號通路,并誘導(dǎo)牙周膜細(xì)胞成骨向分化。因此,PERK-eIF2α-ATF4信號通路的激活可能對正畸牙移動過程、牙周的改建以及牙周膜細(xì)胞的成骨分化有重要影響。