陳美群，扎西拉姆，潘瑛子

(西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所,西藏 拉薩 850032)

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides))是一種革蘭氏陰性、氧化酶陽性的運動性桿菌，隸屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)鄰單胞菌屬(PlesiomonasHabs and Schubert,1962)內(nèi)唯一的一個種[1]。該菌是一種全球性分布細(xì)菌，池塘、淡水，地表水等水體是其主要生活環(huán)境，而水生動物尤其魚類是其主要宿主[2-12]。同時，該菌是一種人-獸共患病原菌[13]，被認(rèn)為是通過水和食物傳播的胃腸道感染暴發(fā)的病原體[14-15]，該菌可引起急性腸胃炎、腹瀉等癥狀，還可以引起腦膜炎、敗血癥、蜂窩組織炎、肺炎等腸外感染癥狀[16-24]，為此受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。引起魚類患病的致病菌種類繁多，而且有些患病魚類發(fā)病的相似癥狀是由不同病原菌引起的，此外同種致病性類志賀鄰單胞菌在不同魚種中發(fā)病的癥狀也會有差異，加之類志賀鄰單胞菌引起魚類發(fā)病愈加頻繁，往往由于不能及時鑒定病原菌而延誤治療，不僅給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟損失，而且也給消費者帶來了一定的健康安全隱患。為此快速、準(zhǔn)確的鑒別出病原菌，并有針對性的選擇對癥藥物進(jìn)行防治顯得尤為重要。目前，對類志賀鄰單胞菌的常用檢測診斷方法主要分為以下三大類。

1 傳統(tǒng)檢測技術(shù)

1.1 選擇性培養(yǎng)基法

Miller[25]和Levin[26]比較了2種固體培養(yǎng)基(PL和IBB)對水生樣品中類志賀鄰單胞菌的分離和恢復(fù)效果，研究發(fā)現(xiàn)在競爭微生物水平較低的樣品或已受到低溫、高溫等損傷的樣品中，使用PL培養(yǎng)基回收類志賀鄰單胞菌效果較好；而對于雜菌高度污染的樣品，使用IBB培養(yǎng)基對類志賀鄰單胞菌的回收率會更高。Freund 等[27]對5種不同的富集方法(革蘭氏陰性肉湯、堿性蛋白胨水、無碘四硫酸鹽肉湯和兩種單胞菌肉湯)與淡水樣品直接涂布法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明四硫酸鹽肉湯對類志賀鄰單胞菌的回收率明顯高于其他四種肉湯(P<0.05)，且也明顯高于直接涂布法，建議在常規(guī)檢測類志賀鄰單胞菌時，在直接涂布前使用四硫酸鹽肉湯在40 ℃進(jìn)行富集培養(yǎng)。Huq等[28]比較了3種培養(yǎng)基(PDA、IBB、MSS)在不同溫度下對類志賀鄰單胞菌和氣單胞菌屬細(xì)菌的分離效果，研究發(fā)現(xiàn)有氣單胞菌存在的情況下，選擇PDA培養(yǎng)基于44 ℃孵育24 h后類志賀鄰單胞菌分離效果較好。由于類志賀鄰單胞菌與氣單胞菌具有一些共同的特性，并且此二菌在一些腸道培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)相似，難以區(qū)別，為了篩選出一種制作簡單，便于觀察，可提高類志賀鄰單胞菌分離率及準(zhǔn)確率的培養(yǎng)基，李槿年[29]比較了類志賀鄰單胞菌和嗜水氣單胞菌在5種不同培養(yǎng)基上的生長情況及菌落特性，發(fā)現(xiàn)改良去氧膽酸鈉瓊脂(改良DC)分離效果最好。為了提高類志賀鄰單胞菌的檢出率，王素秋等[30]選擇了幾種常用的增菌液和4種選擇性分離用培養(yǎng)基，對該菌的檢出效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明使用雙倍堿性胨水和氯化鍶胨水兩次增菌后，再用改良DC平板分離效果最佳，比常規(guī)檢測法的檢出率提高了幾十倍，具有顯著性意義。

表1 類志賀鄰單胞菌的部分選擇性分離培養(yǎng)基

1.2 生理生化鑒定技術(shù)

傳統(tǒng)生理生化鑒定技術(shù)是依據(jù)《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)手冊》或《常見細(xì)菌系統(tǒng)學(xué)鑒定手冊》等，結(jié)合形態(tài)及一些生理生化反應(yīng)特征來對細(xì)菌進(jìn)行鑒定[31]。傳統(tǒng)生理生化鑒定技術(shù)結(jié)果準(zhǔn)確、可信度較高，但是檢測項目多、耗時長，不利于細(xì)菌性疾病的快速診斷與防治。為此，一些依賴于全部或部分測定生化反應(yīng)指標(biāo)的編碼鑒定法以及自動化鑒定系統(tǒng)被逐漸開發(fā)出來。李槿年[32]采用國產(chǎn)革蘭氏陰性桿菌編碼鑒定系列培養(yǎng)基對28 株分離自安徽省內(nèi)養(yǎng)殖場發(fā)病魚、鱉、蟹等水產(chǎn)動物體內(nèi)的致病細(xì)菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示2株細(xì)菌未能得到鑒定外，其余26株細(xì)菌均可鑒定到屬或種水平，可鑒定率為92.86 %，該編碼鑒定法比傳統(tǒng)生理生化鑒定法操作更為簡便、快速(24～48 h)和準(zhǔn)確，同時又克服了自動化鑒定系統(tǒng)需要昂貴儀器的缺點，因此具有較高的實用價值。根據(jù)相關(guān)報道，目前主要應(yīng)用API細(xì)菌鑒定系統(tǒng)[33]、ID32E微量多項試驗鑒定系統(tǒng)[34]、BD PhoenixTM-100 全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)[35]、ATB 細(xì)菌鑒定儀[36]、GYZ-15eV 生化檢測試劑盒和BIOLOG 自動微生物鑒定系統(tǒng)[37]等自動化鑒定系統(tǒng)對類志賀鄰單胞菌進(jìn)行生化鑒定，自動化鑒定系統(tǒng)具有快捷、準(zhǔn)確、靈敏、高效等優(yōu)點，但自動化鑒定儀價格昂貴，一般基層單位難以推廣應(yīng)用。

2 免疫學(xué)診斷技術(shù)

免疫學(xué)診斷技術(shù)主要是通過利用抗原抗體間的特異性反應(yīng)而開發(fā)的一系列病原檢測技術(shù)，由于該技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、可快速檢測病原等特點，在魚類疾病診斷中得到廣泛應(yīng)用。張新艷[38]研究制備了兔抗類志賀鄰單胞菌血清，效價為1∶1.28×105，并建立了間接ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗)檢測方法，檢測靈敏度為1.0×104CFU·mL-1，制備的多克隆抗體具有良好的檢測特異性，與其它弧菌科水產(chǎn)常見病原菌均無交叉反應(yīng)，可用于特異性檢測類志賀鄰單胞菌，為該菌的快速檢測和疾病的早期診斷與治療提供了研究基礎(chǔ)。

3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)是通過鑒定病原核酸來確認(rèn)病原體，該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點，而傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法費時費力，試驗結(jié)果穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，因此分子生物學(xué)檢測技術(shù)可以起到很好的補充作用。隨著DNA提取技術(shù)的完善、PCR技術(shù)的日益成熟以及各種分子探針標(biāo)記的發(fā)展，由此建立起的以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))、核酸雜交技術(shù)、序列對比技術(shù)及熒光定量PCR技術(shù)等為代表的多種分子生物學(xué)檢測方法的應(yīng)用越發(fā)廣泛。

DNA酶和蛋白酶會降低DNA的擴增水平，據(jù)有關(guān)報道甲醛能破壞組織樣本中的DNA酶和蛋白酶[39-42]。在PCR反應(yīng)中添加牛血清白蛋白(BSA)可提高PCR反應(yīng)產(chǎn)物的擴增[43-44]，BSA和DNA純化均略有降低PCR抑制，但是，每個PCR反應(yīng)中添加的BSA的量應(yīng)該優(yōu)化。 Levin等[45]研究了不同的處理方法(添加甲醛、添加BSA和DNA純化)對PCR定量檢測蛤蚌和牡蠣中類志賀鄰單胞菌的影響，研究表明在未富集的蛤蚌組織中檢測到類志賀鄰單胞菌的水平為200 CFU/g，而在PCR反應(yīng)或DNA純化體系中加入0.1 %牛血清白蛋白(BSA)，檢測水平降低到60 CFU/g；未富集的牡蠣組織樣本對PCR反應(yīng)有明顯抑制作用，類志賀鄰單胞菌的檢測水平為6×105CFU/g，在牡蠣組織勻漿中加入4.0 %甲醛后，大大降低了PCR抑制，檢測水平下降到6×102CFU/g；DNA純化或BSA均略微提高了PCR的靈敏度，檢測水平下降到2×105CFU/g；甲醛+ BSA、甲醛+ DNA純化、甲醛+ BSA + DNA純化處理組合，牡蠣組織中類志賀鄰單胞菌的檢測水平均為2×102CFU/g。Levin等[46]又研究了通過甲醛處理牡蠣組織勻漿、差速離心和包埋有熒光假單胞菌的活性炭處理樣品去除PCR抑制劑的創(chuàng)新方法，用于實時PCR定量檢測牡蠣中類志賀鄰單胞菌，結(jié)果表明甲醛或涂層炭處理牡蠣組織樣品均可顯著降低PCR抑制，先用甲醛處理樣品，再用覆膜炭處理牡蠣樣品，可進(jìn)一步降低了PCR抑制，使每克樣品的最低檢測水平為1×103個基因組目標(biāo)，相當(dāng)于每RT-PCR檢測水平為25個基因組目標(biāo)。

Gonzalez-Rey等[47]研究發(fā)現(xiàn)類志賀鄰單胞菌23S rRNA基因(C-906, G-1189)具有較高的變異性，針對該區(qū)域設(shè)計得兩條引物能夠區(qū)分類志賀鄰單胞菌和變形桿菌、弧菌、氣單胞菌等在基因上密切相關(guān)的細(xì)菌種類，利用該引物對水生環(huán)境、動物和人類腹瀉病例中的類志賀鄰單胞菌進(jìn)行特異性檢測效果較好。張新艷等[48]通過比對已知類志賀鄰單胞菌與弧菌屬、氣單胞菌屬的23S rRNA序列，設(shè)計了類志賀鄰單胞菌特異引物PS23F(5’-CTCCGAATACCGTAGAGTGCTATCC-3’)，PS23R(5’-CTCCCCTAGCCCAATAACACCTAAA-3’)，對類志賀鄰單胞菌和弧菌科水產(chǎn)常見致病菌進(jìn)行特異性擴增，只有類志賀鄰單胞菌擴增結(jié)果為陽性、其他菌株擴增結(jié)果均為陰性。Herrera等[49]針對類志賀鄰單胞菌 hugA 基因設(shè)計了一組特異性引物，研究表明該特異性引物擴增片段長度435 bp，對魚肉中類志賀鄰單胞菌檢測效果較好。孟雙等[50-51]以類志賀鄰單胞菌hugA基因為靶點，設(shè)計了環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)方法，該方法可快速、特異、靈敏地檢測類志賀鄰單胞菌，對33株非類志賀鄰單胞菌菌株均未檢出，同時該方法的靈敏度比普通聚合酶鏈反應(yīng)高100倍，是一種快速、靈敏的類志賀鄰單胞菌檢測方法。

熒光定量PCR是通過熒光標(biāo)記的特異性探針或熒光染料，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。孟雙等[52]于2011年將熒光探針運用到類志賀鄰單胞菌的檢測，根據(jù)類志賀鄰單胞菌特異性較高的23S rRNA基因5’端序列設(shè)計了TaqMan探針，建立了類志賀鄰單胞菌實時熒光TaqMan PCR快速檢測方法，該方法對類志賀鄰單胞菌基因組的檢測靈敏度為3×10-2pg/反應(yīng)體系，該檢測體系在檢測30 種其他腸道致病菌時均未產(chǎn)生特異性擴增，該實時熒光TaqMan PCR檢測體系具有靈敏度高、特異性好、快速等優(yōu)點。陳智瑾等[53]采用高靈敏度、低PCR抑制性的EVAGreen染料代替?zhèn)鹘y(tǒng)的SYBR Green I熒光染料，通過采用自制的選擇性增菌液(煌綠肌醇膽鹽肉湯)對樣品進(jìn)行短時間前增菌處理后，大大提高了檢測靈敏度(達(dá)到25 cfu/10 mL)，該方法具有快速、高靈敏度和高特異性以及可應(yīng)用于復(fù)雜樣品的優(yōu)點。嚴(yán)寒秋等[54]對31株經(jīng)傳統(tǒng)生化鑒定為類志賀鄰單胞菌的菌株，利用特異性引物和探針對這31株菌株的23S rRNA基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測，結(jié)果經(jīng)熒光定量PCR檢測只有28株為類志賀鄰單胞菌，研究表明通過生化鑒定和熒光定量PCR分子水平鑒定兩者的有機結(jié)合，不僅能提高類志賀鄰單胞菌鑒定的準(zhǔn)確性，還能提高其檢出率。

4 小 結(jié)

由于病原菌種類繁多，形態(tài)結(jié)構(gòu)(如有無莢膜和鞭毛)和生理生化特性(如產(chǎn)酸產(chǎn)氣等特性)變化較大，因此難以建立一套能針對所有病原菌的檢測方法。普遍做法是在分離純化出病原菌之后，首先對其進(jìn)行生理生化特征鑒定，隨后再根據(jù)之前的結(jié)果進(jìn)行微生物系統(tǒng)和分子生物學(xué)檢測，綜合各項結(jié)果才能給出比較信服的結(jié)論。筆者于2017年從在西藏拉薩國家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地(水溫12 ℃)人工馴養(yǎng)的患病異齒裂腹魚中也分離到類志賀鄰單胞菌。目前對從魚源類志賀鄰單胞菌致病機理的研究較少，但近年來由該菌引起的養(yǎng)殖魚類患病愈加頻繁[55]，給消費者帶來了重大的安全隱患，因此在今后有必要在患病魚類中快速準(zhǔn)確鑒定出致病性類志賀鄰單胞菌的基礎(chǔ)上，還要深入開展該菌致病機理等方面的后續(xù)研究，這對明確該菌對魚類的致病性并控制其傳播具有重要意義。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，目前抗生素經(jīng)常被用來控制微生物性傳染病，但抗生素長期大量反復(fù)使用，容易造成微生物產(chǎn)生耐藥性[56]。筆者從西藏土著魚中還分離出Micrococcussp.、Microbacteriumsp.、Penicilliumsp.、Exiguobacteriumsp.、Arthrobactersp.、Rhizopussp.、Leptosphaeriasp.、Microsphaeropsissp.、Acremoniumsp.等益生菌[57]，計劃后期開展這些菌株對類志賀鄰單胞菌的拮抗作用，提取上述分離微生物的次級代謝產(chǎn)物并開展其抑菌活性分析，以期找到對類志賀鄰單胞菌具有較好抑制作用的新型活性物質(zhì)，為傳統(tǒng)魚類抗生素藥物的替代及該菌的防治提供研究基礎(chǔ)。