汪俊杰，姚 磊，金思怡，司馬秀田

顱咽管瘤作為一種罕見的良性腫瘤，好發(fā)于鞍內(nèi)和鞍上區(qū)域，由于炎癥反應(yīng)與周圍腦組織包繞而難以完全切除，屬于鞍區(qū)難以治療的顱內(nèi)良性病變之一。顱咽管瘤可分為釉質(zhì)上皮型(adamantine epithelioma，AE)和鱗狀乳頭瘤型(squamous papillary tumor，SP)[1]。白細(xì)胞介素33(interleukin-33，IL-33)是細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1家族中的一員，它與Ⅱ型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)有關(guān)[2]。白細(xì)胞介素1受體樣1(interleukin 1 receptor like 1，ST2)ST2結(jié)構(gòu)與IL-1β/IL-1R1復(fù)合物相似，含有100多個(gè)氨基酸[3]。IL-33與ST2結(jié)合在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)。IL-33由輔助2型T細(xì)胞產(chǎn)生，通過募集下游信號(hào)分子MyD88，IL-1R相關(guān)激酶和TRAF6并激活MAPKK反作用于AP-1。TRAF6能激活核因子-κB激酶抑制劑復(fù)活物，從而產(chǎn)生2型輔助T細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究運(yùn)用定量PCR技術(shù)檢測(cè)顱咽管瘤患者IL-33和ST2 mRNA的表達(dá)，對(duì)認(rèn)識(shí)顱咽管腫瘤的發(fā)生發(fā)展和研究治療方法有著重要意義。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料本組研究對(duì)象為顱咽管瘤和腦外傷組織標(biāo)本(對(duì)照組)。樣本均來(lái)自2010年6月至2011年2月在華西醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)的患者，顱咽管瘤標(biāo)本經(jīng)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選出釉質(zhì)上皮型腫瘤21例、鱗狀乳頭瘤型15例，共36例，其中男性20例，女性16例，年齡6～62(29.4±21.5)歲。腦組織標(biāo)本22例來(lái)自腦挫裂傷手術(shù)患者，其中男性15例，女性7例，年齡22～47(32.6±7.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無(wú)家族性疾病病史；②既往無(wú)手術(shù)史；③手術(shù)前無(wú)放療、化療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重多器官疾?。虎诤喜⑸眢w其他部位的腫瘤；③術(shù)后病理切片初篩發(fā)現(xiàn)腫瘤組織稀少，大片壞死及血凝塊等雜質(zhì)過多者。

1.2 總RNA提取所有實(shí)驗(yàn)器械均用0.1%焦炭酸二乙酯(DEPC)水浸泡并高壓滅菌(山東博科 型號(hào)： BKQ-B75II)。取組織塊稱重50 mg，加入1 mL Trizol，組織勻漿機(jī)(型號(hào)：Tissue-Tearor)勻漿，常規(guī)Trizol法(美國(guó)Rothe公司)提取總RNA。

1.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)運(yùn)用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。冰上預(yù)混下列溶液：總RNA 1 μg，隨機(jī)引物1 μL，DEPC水，瞬時(shí)離心，70 ℃預(yù)處理5 min，冰上冷卻。再依次加入：5×反應(yīng)緩沖液4 μL，RibolockTM Ribonuclease Inhibitor (20 μg·μL-1) 1 μL，10 mM dNTP mix 2 μL，瞬時(shí)離心，37 ℃溫育5 min。加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transciptase 1 μL至終反應(yīng)體積為20 μL。42 ℃溫育60 min，70 ℃加熱10 min后終止反應(yīng)，冰浴冷卻。置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)合成引物由上海英俊公司合成：IL-33上游：5’-ATCCCAACAGAAGGCCAAAG-3’，下游：5’-CCAAAGGCAAAGCACTCCAC-3’；ST2上游：5’-GGATTGAGGCCACTCTGCTC-3’，下游：5’-CCGCCT-GCTCTTTCGTATGT-3’。 β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，上游：5’-GGCATCCACGAAACTACCTT-3’，下游：5’-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’。

1.5 定量PCRPCR反應(yīng)體系：2×SYBR(Qiagen公司)5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，DEPC水補(bǔ)足10 μL。Eppendorf定量PCR儀(型號(hào): Mastercyler ep realplex)上設(shè)置反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。以β-actin作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量。

2 結(jié)果

以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照，顱咽管瘤組織中IL-33 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，相對(duì)定量分別為(0.12±0.13)和(0.06±0.08)(實(shí)驗(yàn)組為36例，對(duì)照組為22例)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。顱咽管瘤組織中ST2 mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，相對(duì)定量分別為(0.17±0.18)和(0.04±0.06)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。相關(guān)性分析，IL-33和ST2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.35,P=0.04)，見圖1。

圖1 IL-33和ST2 mRNA表達(dá)量相關(guān)性分析

IL-33和ST2基因在顱咽管瘤組織兩種病理類型(AE和SP)之間進(jìn)行相對(duì)定量分析。結(jié)果顯示：二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

IL-33作為細(xì)胞因子IL-1家族的成員之一，它的作用與Ⅱ型免疫應(yīng)答密切相關(guān)。外源性IL-33的注射可引起身體機(jī)能的多種改變，如嗜酸粒細(xì)胞增多，消化道和呼吸道上皮增生。這些都與IL-33引起的IgE增多有關(guān)。在 信 號(hào) 分 子IL-33與ST2結(jié)合后，以招募型受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用激活A(yù)P-1。TRAF6能激活核因子-κB激酶抑制劑復(fù)活物，從而產(chǎn)生2型輔助T細(xì)胞因子。IL-33在體內(nèi)有很多重要的作用，如抗感染作用、滅菌作用等，Hazlett等[4]在感染銅綠假單胞菌引起角膜炎的BALB/c和B6小鼠中采用免疫組化的方法檢測(cè)到IL-33的表達(dá)以及其蛋白水平明顯增加，且Th-2細(xì)胞因子也顯著上升 。這些研究顯示，IL-33起到了重要作用，它抑制了輔助1型T細(xì)胞因子的產(chǎn)生，后通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)升高2型輔助T細(xì)胞因子的表達(dá)。啟動(dòng)細(xì)胞免疫，利用ADCC效應(yīng)殺滅病原體。IL-33主要對(duì)免疫細(xì)胞的細(xì)胞分化，免疫應(yīng)答等過程起作用，比如，通過TIIST2L調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞。IL-33的刺激對(duì)于CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為2型輔助T細(xì)胞和產(chǎn)生Treg細(xì)胞的過程至關(guān)重要[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，IL-33/ST2 mRNA在多組腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)較高，有文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌中血清的IL-33含量明顯高于健康組[5]。但沒有顱咽管瘤與IL-33含量之間關(guān)系的相關(guān)研究。本研究運(yùn)用定量PCR技術(shù)檢測(cè)顱咽管瘤中IL-33/ST2 mRNA基因的表達(dá)量，并探討IL-33/ST2 mRNA表達(dá)與顱咽管瘤臨床癥狀和分型的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)顱咽管瘤中IL-33和ST2 mRNA表達(dá)明顯增高，并且兩者呈正相關(guān)。其中r=0.35，表明相關(guān)性不強(qiáng)，具體原因有待進(jìn)一步研究。已有很多文獻(xiàn)揭示IL-33在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，例如，結(jié)直腸癌中增強(qiáng)的IL-33/ST2 mRNA促進(jìn)了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[6]，卵巢癌中增加的IL-33促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[7]?；谝陨涎芯?，IL-33有望在未來(lái)成為顱咽管瘤臨床診斷、手術(shù)預(yù)后判斷的新的生物學(xué)指標(biāo)。

近年來(lái)，關(guān)于顱咽管瘤診斷的研究已進(jìn)入到分子細(xì)胞水平，mRNA表達(dá)的研究證實(shí)其在顱咽管瘤的臨床診斷中的重要作用，但還需要更多的研究以證實(shí)其在發(fā)病機(jī)理及術(shù)后愈合中的作用。