王小利 ，許德英，孫真真，白嬌紅，艾紅偉，常永超

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是原癌基因c-erbB1的表達(dá)產(chǎn)物，與細(xì)胞的生長、增殖和分化等過程密切相關(guān)，也是多種腫瘤的重要靶標(biāo)分子。p53是一種編碼核磷酸蛋白的重要抑癌基因，但其突變會(huì)導(dǎo)致癌變。ki-67是一種與細(xì)胞周期密切相關(guān)的核蛋白，可判斷腫瘤的增殖情況，并在乳腺癌的臨床預(yù)后中有重要意義[2]。雄激素受體(androgen receptor，AR)是類固醇激素受體家族中的一員，也是一種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)乳腺癌的診治存在臨床價(jià)值。目前乳腺癌的診療分子標(biāo)志物有多種，但對(duì)聯(lián)合檢測乳腺癌的分子靶標(biāo)評(píng)價(jià)報(bào)道還較少，且一般認(rèn)為一期乳腺癌的5 a治愈率90%～95%，二期約70%～80%，三期約50%～60%，四期則低于10%，而臨床中四期患者較少，所以作者隨訪時(shí)間均超過5 a。本研究主要通過免疫組化(immunohistochemistry，IHC)方法檢測乳腺癌組織中EGFR、p53、ki-67及AR等分子標(biāo)志物的表達(dá)，分析其與患者臨床病理特征間的關(guān)系，并探討其對(duì)乳腺癌患者的臨床預(yù)后意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料組織芯片購于上海芯超生物科技公司，共145例樣本，手術(shù)時(shí)間為2005年8月至2009年12月，隨訪至2015年7月，隨訪時(shí)間5.6～10 a，中位生存時(shí)間77(2～119)個(gè)月，術(shù)前均未接受乳腺相關(guān)治療，病史資料完整，均為女性，中位年齡59.50(33～88)歲，HE染色驗(yàn)證其符合組織病理學(xué)特征。

1.2 主要試劑抗ER、PR、Her-2、EGFR、p53、Ki67及AR抗體均購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 IHC方法操作步驟嚴(yán)格按照生物素—鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(無錫傲銳東源)說明書進(jìn)行，抗原修復(fù)采用高壓修復(fù)法，陰性對(duì)照為PBS磷酸緩沖液代替一抗。

1.4 FISH方法按照熒光原位雜交技術(shù)(fluorescent in situ hybridazation，F(xiàn)ISH)檢測試劑盒(廣州安必平)進(jìn)行操作，Her-2/CEP17比率大于2.2定義為HER2基因擴(kuò)增。

1.5 結(jié)果判斷評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參照許良中的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3]，隨機(jī)觀察不重復(fù)的高倍(×200)視野4～5個(gè)，計(jì)數(shù)100～200個(gè)腫瘤細(xì)胞；染色境界清晰、背景突出的棕黃色或棕褐色顆粒定義陽性細(xì)胞；根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)量及著色程度進(jìn)行半定量分析。陽性細(xì)胞數(shù)量：陽性細(xì)胞<1%，計(jì)0分；1%≤陽性細(xì)胞數(shù)≤30%，計(jì)1分；31%≤陽性細(xì)胞數(shù)≤70%，計(jì)2分；71%≤陽性細(xì)胞數(shù)≤100%，計(jì)3 分；著色程度：0分為不著色；1分為淺棕色；2分為棕黃色；3分為棕揭色。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)累計(jì)相加：<3分為陰性(-)，≥3分為陽性(+)，分為兩組進(jìn)行分析；Ki67陽性定義為癌細(xì)胞核著色≥20%[4-5]；HER-2陽性為IHC染色強(qiáng)度≥5分和/或FISH檢測HER-2基因擴(kuò)增，陰性為IHC染色強(qiáng)度<3分和(或)FISH檢測HER-2基因無擴(kuò)增。

1.6 分型標(biāo)準(zhǔn)分子分型標(biāo)準(zhǔn)為2013年第十三屆St.Gallen國際乳腺癌會(huì)議專家共識(shí)[4-5]，即：①Luminal A型：免疫組織化檢測結(jié)果為ER陽性和/或PR陽性，Her-2陰性，Ki67<20%；②Luminal B型：ER陽性和/或PR陽性，Her-2陽性；或ER陽性和/或PR陽性，Her-2陰性，ki-67≥20%；③Her-2過表達(dá)型：ER、PR陰性，Her-2陽性，ki-67多為高表達(dá)；④Basical-like型：ER、PR陰性/Her-2陰性。本組研究對(duì)象145例乳腺癌，其中Luminal A型44例，Luminal B型32例，Her-2過表達(dá)型30例，Basical-like型38例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0 及Graphpad Prism7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Fisher 確切檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)分析蛋白表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系。Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸比例模型分析影響乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Kaplan-Meier 法計(jì)算生存曲線，單因素生存曲線采用Log-rank方法比較差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、p53、ki-67及AR的表達(dá)IHC結(jié)果顯示EGFR陽性表達(dá)定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，是一種分泌性蛋白；p53、ki-67及AR定位于細(xì)胞核，見圖1。EGFR、p53、ki-67及AR在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)分別為41.38%(60/145)、72.41%(105/145)、36.55%(53/145)及55.86%(81/145)，見表1。

2.2 EGFR、p53、ki-67及AR表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系在145例乳腺癌組織中，EGFR、ki-67的表達(dá)與病理學(xué)分級(jí)及分子亞型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與年齡大小、腫物大小以及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；p53的表達(dá)則與年齡大小、腫物大小、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級(jí)及分子分型分類間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AR的表達(dá)則除了與年齡大小間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，與其余4種臨床病理特征間差異均有相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

D圖為FISH法檢測Her-2基因擴(kuò)增(×1 000)，其余圖均為IHC法檢測(×200)。圖1 ER、PR、Her-2、EGFR、p53、ki-67及AR陽性表達(dá)情況

2.3 EGFR、p53、ki-67及AR與乳腺癌的預(yù)后Cox多因素回歸分析顯示EGFR的差異性表達(dá)可作為影響乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，HR=1.55，95%Cl=1.02～2.36)，見表2。而K-M曲線顯示EGFR、p53、ki-67及AR的差異性表達(dá)與腫瘤的累計(jì)生存率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

3 討論

基因組研究分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病。根據(jù)分子表型可將乳腺癌分為4類[4-5]，治療措施也各不相同，故研究不同分子標(biāo)志物在各類分子亞型乳腺癌中的表達(dá)意義非常重要，且Basical-like型乳腺癌與三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)約有80%的重合，而TNBC又具備局部復(fù)發(fā)率高、侵襲性強(qiáng)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移早且預(yù)后差等特征。

表2 Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析影響乳腺癌患者獨(dú)立預(yù)后因素

A:EGFR; B:p53; C:ki-67; D:AR。圖2 K-M法計(jì)算EGFR、p53、ki-67、AR在乳腺癌中的累計(jì)生存率

EGFR是一種表皮生長因子受體，在多種腫瘤中常異常表達(dá)。該研究顯示EGFR在乳腺癌中的總體陽性率為41.38%，在Her-2過表達(dá)和Basical-like型中的陽性表達(dá)率高達(dá)73.33%和78.95%，而在Luminal型乳腺癌中的表達(dá)率很低，提示EGFR對(duì)Her-2過表達(dá)和Basical-like型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可能起重要作用。且EGFR可作為乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這可能與EGFR異常表達(dá)的生物學(xué)特性，即促使癌細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移、抑制凋亡等有關(guān)。所以EGFR表達(dá)水平或基因突變狀態(tài)越來越多地被用于乳腺癌患者的靶向治療。

p53是一種重要的抑癌基因。有研究表明，20%～35%的乳腺癌均存在p53基因突變，在TNBC中的突變率更高[6]。本研究顯示在乳腺癌中p53的陽性表達(dá)率達(dá)72.41%，在Her-2過表達(dá)和Basical-like型中的陽性表達(dá)率高達(dá)73.33%和86.84%，但p53的差異性表達(dá)與乳腺癌的臨床病理特征均不存在相關(guān)性，這可能是由于在大多數(shù)腫瘤中p53基因突變率較高但特異性較差的緣故，也有可能由于本次研究樣本例數(shù)較少。

ki-67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，也是Luminal B型乳腺癌分型的分子依據(jù)之一。本研究中ki-67的陽性表達(dá)率36.55%，在Luminal B型和Basical-like型中的表達(dá)率為69.70%和55.26%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與年齡、腫瘤大小和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性；但在TNBC中，有報(bào)道稱ki-67高表達(dá)與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，而與年齡、臨床分期無相關(guān)性，且提示Ki67可能是TNBC患者預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)[7-8]，由于本次TNBC樣本數(shù)有限，并未做該方面的研究。

AR是雄激素受體，在本研究中陽性表達(dá)率為55.86%，與Chen C等[9]報(bào)道的陽性率基本一致，且腫瘤越大、病理學(xué)分級(jí)越高、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者AR的表達(dá)率越高。McGhan等[10]也發(fā)現(xiàn)AR陽性的TNBC與高病理學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。在本研究中Luminal A型中的表達(dá)率最高達(dá)79.55%，而在Basical-like型中表達(dá)并不高，表明AR的高表達(dá)可能與ER和PR的高表達(dá)具有相關(guān)性。Millis等[11]評(píng)估了6 341例乳腺癌患者，結(jié)果顯示TNBC中AR表達(dá)越高，ki-67水平越低，提示雄激素可能具有抗增殖作用。而本研究病例數(shù)有限，暫不能準(zhǔn)確說明AR與ki-67表達(dá)的相關(guān)性。

本研究表明EGFR、p53、ki-67及AR的表達(dá)對(duì)乳腺癌患者的累計(jì)生存率并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于隨訪時(shí)間不夠長，因?yàn)橛醒芯勘砻鱁GFR和ki-67在單因素分析中對(duì)乳腺癌患者5 a無病生存率具有預(yù)測意義，而AR和p53沒有[9]。有報(bào)道稱ki-67表達(dá)與激素受體陰性的乳腺癌患者生存率無相關(guān)性，但對(duì)激素受體陽性的乳腺癌患者預(yù)后具有預(yù)測價(jià)值[12]。也有研究顯示在TNBC中，p53基因突變率越高，患者的預(yù)后越差[13-14]。

總之，針對(duì)乳腺癌患者不單需要檢測ER、PR和Her-2的表達(dá)狀態(tài)，更應(yīng)聯(lián)合檢測 EGFR、p53、ki-67和AR等分子標(biāo)志物，這樣有助于綜合評(píng)價(jià)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，有效評(píng)估臨床預(yù)后，為臨床提供更佳治療方案，也有助于患者的個(gè)體化治療而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療。