王晨瑩，董曉輝，王 貝，王冬梅

化療相關(guān)的認(rèn)知障礙(chemotherapy-related cognitive impairment，CRCI)，也稱化療腦(chemo brain)，是在進(jìn)行化療藥物治療后出現(xiàn)的認(rèn)知障礙，包括廣泛的神經(jīng)問題，如注意力、執(zhí)行功能、記憶力和處理速度方面的障礙[1-2]。這些認(rèn)知障礙通常會持續(xù)很長時(shí)間，并對生活質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響[3-5]。研究顯示，鉑類化療藥物順鉑在臨床的應(yīng)用與CRCI的高發(fā)率密切相關(guān)。目前，大多數(shù)關(guān)于化療腦的研究都集中在乳腺癌患者身上[6-7]。對于嚙齒類動(dòng)物的臨床研究表明，通常用于乳腺癌的藥物(如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶和環(huán)磷酰胺等)會引起認(rèn)知障礙，這與神經(jīng)炎癥和神經(jīng)發(fā)生障礙有關(guān)[8-10]。但化療相關(guān)認(rèn)知障礙的潛在機(jī)制尚不清楚，目前尚無有效的治療方法。最近研究發(fā)現(xiàn)，化療引起的大腦線粒體損傷在CRCI中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用[11-12]。乙酰左旋肉堿具有線粒體和神經(jīng)保護(hù)的作用[13-14]，本研究探討乙酰左旋肉堿對順鉑誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57BL/6小鼠38只，體質(zhì)量25～30 g。藥品與試劑：順鉑(購自sigma公司)；乙酰左旋肉堿(上海TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；高爾基染色試劑盒購自美國Hitobiotec公司；尼氏染色試劑盒、線粒體—胞質(zhì)蛋白制備試劑盒和線粒體膜電位檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；線粒體ATP合成生物發(fā)光檢測試劑盒、線粒體細(xì)胞色素c氧化酶活性測定試劑盒(美國GENMED SCINTIFICS INC生物公司)。儀器：MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)(荷蘭Noldus公司Ethovision XT軟件)。

1.2 分組與給藥C57BL/6小鼠(25～30 g)38只隨機(jī)分為4組(n=8～10)：對照組(Control組)，乙酰左旋肉堿單獨(dú)組(Acetyl-L組)，化療腦組(Cisplatin組)，乙酰左旋肉堿治療化療腦組(Cis/Acetyl-L)。連續(xù)5 d腹腔注射2.3 mg·kg-1順鉑，5 d不注射，為1個(gè)周期，連續(xù)進(jìn)行3個(gè)周期構(gòu)建化療腦模型(Cisplatin組)，在順鉑注射1 h前腹腔注射乙酰左旋肉堿(150 mg·kg-1)進(jìn)行治療(Cis/Acetyl-L)。Control組腹腔注射等劑量的Cisplatin溶劑(無菌生理鹽水)和腹腔注射乙酰左旋肉堿溶劑，Acetyl-L組腹腔注射等劑量的Cisplatin溶劑和腹腔注射乙酰左旋肉堿(150 mg·kg-1)。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)和記憶功能平臺隱藏實(shí)驗(yàn)中：每天在同一時(shí)間段訓(xùn)練小鼠4次，分別從4個(gè)不同象限將小鼠面壁置入池內(nèi)，不同的小鼠在相同的位置下水。每次游泳時(shí)間60 s，找到平臺，并在上面停留3 s以上者，視為找到平臺；60 s內(nèi)沒有找到平臺的要將其引導(dǎo)到平臺上，停留15 s；小鼠沒有找到平臺按60 s計(jì)算潛伏期。每次訓(xùn)練間隔1 h左右?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：第五天，把放置在第三象限的平臺拿走，任選一個(gè)入水點(diǎn)將小鼠放入水中，小鼠在水中游泳60 s，主要記錄小鼠在平臺區(qū)出現(xiàn)的頻次，小鼠在目標(biāo)象限(原平臺所在象限)和其他各象限的游泳時(shí)間，數(shù)據(jù)搜集和處理由Morris水迷宮系統(tǒng)軟件完成。

1.3.2 用尼氏染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，每組隨機(jī)抽出3～4只小鼠進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。用4%多聚甲醛心臟灌注取腦、固定、石蠟包埋，常規(guī)脫蠟至水。切片入尼氏染色液1(cresyl violet stain)，56 ℃浸染1 h，冷蒸餾水沖洗后，入尼氏染色液2(Nissl differentiation)分化1～3 min，至顯微鏡下觀察至背景接近于無色為止。隨后無水乙醇迅速脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)，并拍照。

1.3.3 用高爾基染色觀察樹突棘密度行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，每組隨機(jī)抽出2～3只小鼠，迅速取出腦組織，嚴(yán)格按照高爾基染色試劑盒說明書進(jìn)行浸泡、包埋、切片(厚度80 μm)、染色、脫水、透明、封片、觀察結(jié)果。

1.3.4 線粒體分離和功能檢測頸椎脫臼法犧牲小鼠后，剝離的海馬置于預(yù)冷的生理鹽水沖洗，線粒體分離具體方法參照文獻(xiàn)[8]。細(xì)胞色素C氧化酶活性以還原型細(xì)胞色素C(Cyt C)在550 nm，下被氧化的速度，以變化的吸光度值表示細(xì)胞色素C氧化酶活性。提取的線粒體與外源底物谷氨酸鉀及ADP孵育，采用熒光法檢測ATP產(chǎn)生速率。線粒體膜電位(mΔΨ)：線粒體懸液中加入含2 μM JC-1的檢測體系中，微型轉(zhuǎn)子攪拌下室溫孵育30 min，離心去除未結(jié)合線粒體的JC-1，488 nm激發(fā)光下讀取熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

預(yù)實(shí)驗(yàn)中選擇了低中高3個(gè)不同的劑量(50、100、150 mg·kg-1·d-1)作用化療腦(Cisplatin組)小鼠，通過行為學(xué)確定乙酰左旋肉堿的最佳劑量。結(jié)果顯示，只有高劑量(150 mg·kg-1·d-1)乙酰左旋肉堿，治療后均能顯著改善化療腦組小鼠的認(rèn)知能力(表現(xiàn)為與化療腦組小鼠相比，空間探索實(shí)驗(yàn)中靶象限滯留時(shí)間顯著增加)。據(jù)此，高劑量的乙酰左旋肉堿(150 mg·kg-1·d-1)被選作進(jìn)一步研究的最佳用量。

為了研究乙酰左旋肉堿對順鉑誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的作用，4組實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，不同組間的小鼠潛伏期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(3,34)=6.75，P<0.05]。如圖1所示，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組小鼠找到平臺的潛伏期較之前一天均逐漸縮短[F(4,136)=126.01，P<0.05]。然而，與對照組小鼠相比，Cisplatin組小鼠尋找平臺的潛伏期顯著延長(P<0.05)；而乙酰左旋肉堿(200 mg·kg-1·d-1)治療可以明顯縮短化療腦小鼠的潛伏期(P<0.05)。結(jié)果表明乙酰左旋肉堿能夠促進(jìn)化療腦小鼠的空間學(xué)習(xí)能力。

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠在靶象限滯留時(shí)間[F(3,56)=31.16，P<0.05]差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cisplatin組小鼠在靶象限滯留時(shí)間[(16.60±1.61) s VS (27.80±1.01) s，P<0.05]明顯少于對照組小鼠；而乙酰左旋肉堿(200 mg·kg-1·d-1)治療可以顯著增加Cisplatin組小鼠在靶象限限滯留時(shí)間[(25.07±1.23) s VS (16.60±1.61) s,P<0.05](圖2-3)。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠在速度(圖4)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明乙酰左旋肉堿并不是通過速度或者其他動(dòng)力因素改善了記憶功能。見圖1。

2.2 尼氏染色與對照組小鼠相比，Cisplatin組小鼠海馬CA1區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞增生、排列紊亂、尼氏小體數(shù)目明顯減少，細(xì)胞體積明顯縮小、形態(tài)不規(guī)則、核仁少見，細(xì)胞間距增大、輪廓模糊、界限不清。乙酰左旋肉堿治療后能夠顯著增加尼氏小體數(shù)目。對照組與乙酰左旋肉堿單用組相比，CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊、胞核核仁明顯，尼氏小體數(shù)目較多、輪廓清晰。結(jié)果表明：乙酰左旋肉堿對順鉑誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。見圖5。

①與對照組相比，P<0.05；②與Cisplatin組相比，P<0.05。圖1 定位航行實(shí)驗(yàn)潛伏期分析

圖2 空間探索實(shí)驗(yàn)軌跡圖

①與對照組相比，P<0.05；②與Cisplatin組相比，P<0.05。圖3 空間探索實(shí)驗(yàn)平臺象限滯留時(shí)間分析

圖4 空間探索實(shí)驗(yàn)總路徑

2.3 高爾基染色與對照組小鼠相比，Cisplatin組小鼠CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度顯著減少(P<0.05)；而乙酰左旋肉堿治療后能夠顯著增加Cisplatin組小鼠的樹突棘密度(P<0.05)。對照組與乙酰左旋肉堿單用組相比，CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度沒有差異。結(jié)果表明：乙酰左旋肉堿緩解Cisplatin誘導(dǎo)的小鼠CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘的丟失，緩解突觸損傷(見圖6-7)。

圖5 實(shí)驗(yàn)組小鼠CA1區(qū)錐體神經(jīng)元尼氏染色情況(尼氏染色，×400)

圖6 CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度(高爾基染色，×100)

①與對照組相比，P<0.05；②與Cisplatin組相比，P<0.05。圖7 樹突棘密度分析

2.4 線粒體功能順鉑能夠損傷線粒體功能，引起ATP合成減少，能量缺乏(表現(xiàn)為與對照組小鼠相比，Cisplatin組小鼠細(xì)胞色素c氧化酶活性降低(P<0.01)，ATP合成能力(P<0.05)以及線粒體膜電勢均下降(P<0.05)。與Cisplatin組小鼠相比，Cis/Acetyl-L組小鼠腦組織細(xì)胞色素c氧化酶活性增加了50.13%(P<0.05)，ATP合成能力增加了33.28%(P<0.05)，線粒體膜電勢增加了31.32%(P<0.05)。對照組與乙酰左旋肉堿單用組相比，細(xì)胞色素c氧化酶活性，ATP合成能力以及線粒體膜電勢均沒有差異。結(jié)果表明：乙酰左旋肉堿緩解Cisplatin誘導(dǎo)的小鼠腦組織線粒體失功能。見圖8-10。

①與對照組相比，P<0.05；②與Cisplatin組相比，P<0.05。圖8 細(xì)胞色素c氧化酶活性

①與對照組相比，P<0.05；②與Cisplatin組相比，P<0.05。圖9 ATP合成能力

①與對照組相比，P<0.05；②與Cisplatin組相比，P<0.05。圖10 線粒體膜電勢

3 討論

對CRCI的深入研究表明，化療誘導(dǎo)的腦線粒體病變在CRCI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。順鉑化療對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生神經(jīng)毒性，與CRCI的高發(fā)率密切相關(guān)。順鉑能夠通過血腦屏障，在腦實(shí)質(zhì)和海馬區(qū)域聚集。順鉑引起的氧化磷酸化效率損傷、ATP供應(yīng)障礙、氧化應(yīng)激和鈣穩(wěn)態(tài)紊亂作為神經(jīng)元線粒體功能損傷的重要病理基礎(chǔ)，參與CRCI的發(fā)生發(fā)展。順鉑可以誘導(dǎo)線粒體DNA(mtDNA)損傷，并在培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元和NSCs中損害呼吸活性。順鉑通過促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，誘導(dǎo)線粒體氧化損傷和凋亡，抑制抗氧化酶和釋放自由基。線粒體功能障礙會增加氧化應(yīng)激，從而刺激自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致樹突棘的損失。在動(dòng)物模型中順鉑引起的認(rèn)知損傷與神經(jīng)元樹突棘和突觸密度的急劇減少呈正相關(guān)[15]。順鉑引起的ATP供應(yīng)障礙、氧化應(yīng)激和鈣穩(wěn)態(tài)紊亂作為神經(jīng)元線粒體功能損傷的重要病理基礎(chǔ)，參與CRCI的發(fā)生發(fā)展。在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，順鉑誘導(dǎo)mtDNA損傷，引起線粒體腫脹或空泡變性，神經(jīng)元死亡。因此，改善線粒體功能的方法和策略能夠緩解化療誘導(dǎo)腦損傷和認(rèn)知功能。本研究通過對小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的測定，表明乙酰左旋肉堿可以通過緩解線粒體功能損傷而減少樹突棘損失，改善突觸功能，同時(shí)還可促進(jìn)海馬組織內(nèi)尼氏體的修復(fù)，改善順鉑誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

乙酰左旋肉堿(ALCAR)具有線粒體保護(hù)功能，能有效防止氧化應(yīng)激引起的線粒體損傷和隨之產(chǎn)生的線粒體依賴性凋亡[13-14]。乙酰左旋肉堿已經(jīng)被證明可以保護(hù)細(xì)胞免受線粒體和自由基相關(guān)的核DNA損傷，通過減少氧化劑產(chǎn)生和提高抗氧化能力來改善線粒體的功能。乙酰左旋肉堿是一種內(nèi)源性的代謝中間體，在大腦中存在，參與了乙?；诖x和合成代謝過程中的傳輸，并緩沖了乙酰輔酶A。ALCAR是在許多組織中，包括大腦、肝臟、心臟、腎臟、肌肉等，通過將乙?；D(zhuǎn)移到肉堿中合成的，它已經(jīng)被證明可以保護(hù)細(xì)胞免受線粒體和自由基相關(guān)的核DNA損傷，通過減少氧化劑的產(chǎn)生和提高抗氧化的能力來改善線粒體的功能。

本研究結(jié)果顯示，乙酰左旋肉堿能夠明顯改善順鉑誘導(dǎo)的線粒體功能損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞色素c氧化酶活性降低，ATP合成能力以及線粒體膜電勢均下降。線粒體功能障礙會增加氧化應(yīng)激，從而刺激自由基的產(chǎn)生，導(dǎo)致樹突棘的損失。因此，線粒體失功能被認(rèn)為是引起突觸損傷的重要因素，改善者線粒體功能的方法和策略可以有效地保護(hù)突觸可塑性，延緩認(rèn)知的神經(jīng)退行性病變。本研究對小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘密度的測定，表明乙酰左旋肉堿可以通過緩解線粒體功能損傷而減少樹突棘損失，改善突觸功能，同時(shí)還可促進(jìn)海馬組織內(nèi)尼氏體的修復(fù)，最終達(dá)到改善順鉑誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能。但乙酰左旋肉堿對順鉑誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙的詳細(xì)分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步探討。