李欽，邱建武

0 引言

惡性腫瘤的增殖速度與新生血管的生成速度并不完全同步，導(dǎo)致惡性腫瘤內(nèi)部存在缺氧環(huán)境[1]。缺氧是實(shí)體腫瘤的主要生長(zhǎng)特性之一，與腫瘤的血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為密切相關(guān)[2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia induction factor-1α, HIF-1α）在腫瘤的缺氧調(diào)節(jié)中起著重要的紐帶作用[3]；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，對(duì)血管的生成有著無(wú)可替代的作用，同時(shí)其受多種因素調(diào)控，缺氧組織的轉(zhuǎn)錄活化主要受HIF-1α調(diào)節(jié)。學(xué)者普遍認(rèn)為：抑制腫瘤血管生成是顱內(nèi)惡性腫瘤（如腦膠質(zhì)瘤等）的分子治療策略之一[4]。因此，應(yīng)用精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)原理，探索人腦膠質(zhì)瘤基因治療途徑成為熱點(diǎn)。本研究以膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞系為對(duì)象，通過(guò)體外構(gòu)建CoCl2缺氧誘導(dǎo)模型，用基因抑制技術(shù)干預(yù)HIF-1α表達(dá)，進(jìn)而觀(guān)察膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞中，HIF-1α和VEGF表達(dá)的變化，探討HIF-1α在缺氧激活膠質(zhì)瘤血管生成調(diào)節(jié)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞購(gòu)于沈陽(yáng)尚耀試劑公司，小牛血清購(gòu)于MRC公司（產(chǎn)地：澳洲），CoCl2購(gòu)于Macklin公司（上海），DAPI染料購(gòu)于BOSTER公司（武漢），真核表達(dá)載體SpilencerTMnerU6 2.1購(gòu)于A(yíng)mbion公司（美國(guó)）。脂質(zhì)體LipofectamineTM購(gòu)于Invitrogen公司（美國(guó)），qPCR試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司（日本），HIF-1α抗體及VEGF抗體購(gòu)于A(yíng)bcam公司（美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)傳代

將A172細(xì)胞株按要求進(jìn)行復(fù)蘇后接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（37℃、5%CO2培養(yǎng)箱）培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞增殖至90%時(shí)，收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行傳代，胰酶消化并PBS水洗三次，每次5 min。

1.2.2 建立細(xì)胞體外缺氧培養(yǎng)條件

用生長(zhǎng)良好、傳代至3～5代的A172細(xì)胞，于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基（37℃、5%CO2培養(yǎng)箱）中培養(yǎng)，至細(xì)胞密度達(dá)60%加入CoCl2，終濃度為150 μmol/L構(gòu)建體外缺氧培養(yǎng)模型。

1.2.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）檢測(cè)mRNA表達(dá)

A172細(xì)胞置于缺氧條件下培養(yǎng)，收集不同缺氧時(shí)相的培養(yǎng)細(xì)胞（0、8、16和24 h），TRIzol法提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20 μl）組成為：RNA模板2 μl、ACCURT4×2 μl、DEPC水10 μl、ACCURT5×2 μl、5x-ALL-in-one Mix 4 μl。42℃ 50 min、85℃5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。PCR引物序列由蘇州吉瑪基因公司構(gòu)建，見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min、95℃ 2 min、95℃ 15 s、60℃ 40 s，循環(huán)40次。融解曲線(xiàn)：95℃ 15 s、60℃ 15 s、95℃ 15 s。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。數(shù)碼照相并行灰度值比色分析（Gel-pro Analyzer4.0分析軟件）。

1.2.4 HIF-1α真核表達(dá)載體構(gòu)建

在GenBank上查找HIF-1α mRNA序列，參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)出針對(duì)HIF-1α進(jìn)行RNAi作用的靶點(diǎn)：AAAGAGGTGGATATGTCTG GG，進(jìn)行Blast基因同源性分析，以保證基因沉默的特異性，RNA Draw軟件分析mRNA二級(jí)空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)siRNA靶位點(diǎn)，人工合成一對(duì)互補(bǔ)并編碼短發(fā)夾狀siRNA的寡核苷酸鏈（蘇州吉瑪基因公司）。將 2 μl（1 μg/μl）正、反義寡核苷酸鏈等比混合，90℃ 3 min，緩慢冷卻至37℃，培養(yǎng)1 h，退火形成發(fā)夾狀siRNA DNA雙鏈，雙鏈兩端含有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。用T4DNA連接酶將siRNA目的片段插入到Ambion公司提供的線(xiàn)性載體SpilencerTMnerU6 2.1的BamHⅠ和HindⅢ之間。重組體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選Amp抗性克隆。提取質(zhì)粒，測(cè)序法鑒定重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為Psilencer2.1 HIF-1α。測(cè)序分析進(jìn)行重組載體的鑒定。

表1 PCR引物設(shè)計(jì)Table1 PCR primer seguence

1.2.5 免疫熒光（IF）法檢測(cè)HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)

膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加500 μl細(xì)胞混液，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%時(shí)缺氧處理（0、8、16和24 h），每步操作中間均需PBS洗三次，每次5 min。4%多聚甲醛固定15 min，0.3%曲通打孔15 min，羊血清封閉2 h，HIF-1α一抗（0.1%）孵育過(guò)夜，兔二抗孵育2 h，VEGF一抗孵育2 h，鼠二抗孵育2 h，DAPI染核染料孵育2 h，熒光照相分析。

1.2.6 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染A172細(xì)胞

轉(zhuǎn)染前一天無(wú)雙抗培養(yǎng)液接種細(xì)胞到6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%開(kāi)始轉(zhuǎn)染。重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體LipofectamineTM介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至A172細(xì)胞，經(jīng)G418（200 u/ml）篩選得到抗性克隆，同時(shí)轉(zhuǎn)染Psilencer2.1作為陰性對(duì)照。將重組質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選到的抗性克隆細(xì)胞，分別命名為A172/shRNAs-HIF和A172/shRNAs-HIF（neg）。轉(zhuǎn)染完成5 h換正常培養(yǎng)液，缺氧培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞做相關(guān)檢測(cè)。

1.2.7 基因抑制效應(yīng)測(cè)定

未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性組A172細(xì)胞缺氧培養(yǎng)24 h后分別進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)、照相，并進(jìn)行圖像分析。如上述TRIzol法提取各組總RNA，行qPCR檢測(cè)VEGF mRNA的表達(dá)情況。分別提取蛋白，Western blot法檢測(cè)各組HIF-1α蛋白表達(dá)情況：Bradford法測(cè)定蛋白濃度，電泳樣本以L(fǎng)oading Buffer:樣品=1:3比例配制，于95℃～100℃水中煮沸5 min。樣品離心，備用。濃縮膠的濃度為5%（丙烯酰胺（Acr）g/ml），分離膠的濃度為11%（丙烯酰胺（Acr）g/ml）。加入5 μl蛋白Marker，連通電極，調(diào)整電壓80 V直到蛋白Marker的前沿到達(dá)分離膠與濃縮膠分界處。調(diào)整電壓為120 V，電泳1 h，轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），BSA封閉液封閉2 h，加HIF-1α一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS漂洗，兔二抗孵育2 h，TBST搖動(dòng)洗膜3次，每次5 min或更長(zhǎng)，去除殘留的二抗。ECL化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光后，ECL檢測(cè)系統(tǒng)（UVP, LLC, Upland, CA,USA）照相。同時(shí)采用qPCR法和ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)情況。HIF-1α表達(dá)抑制率=（灰度值未轉(zhuǎn)染組-灰度值轉(zhuǎn)染組）／灰度值未轉(zhuǎn)染組×100%；VEGF表達(dá)抑制率=（吸光度值未轉(zhuǎn)染組-吸光度值轉(zhuǎn)染組）／吸光度值未轉(zhuǎn)染組×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，配對(duì)組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧培養(yǎng)后A172細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)

缺氧培養(yǎng)0、8、16和24 h后，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，A172細(xì)胞內(nèi)HIF-1α mRNA在常氧條件下有較高表達(dá)，并且與缺氧培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短無(wú)明顯關(guān)系（P＞0.05），見(jiàn)圖1A；VEGF mRNA在常氧條件下有少量表達(dá)，而在缺氧后顯著升高，與常氧組（0 h）相比，缺氧8、16和24 h后，VEGF mRNA的表達(dá)分別提高了4.65、6.86和8.72倍（P=0.002），各缺氧組之間VEGF mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032），見(jiàn)圖1B，表明缺氧誘導(dǎo)VEGF轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)升高。

圖1 qPCR法檢測(cè)缺氧環(huán)境下A172細(xì)胞HIF-1α(A)和VEGF(B) mRNA表達(dá)情況Figure1 HIF-1α(A) and VEGF(B) mRNA expression in A172 cells under hypoxia detected by qPCR

2.2 缺氧培養(yǎng)對(duì)A172細(xì)胞HIF-1α、VEGF mRNA蛋白表達(dá)的影響

熒光顯微鏡下可見(jiàn)常氧環(huán)境下（0 h）A172細(xì)胞HIF-1α蛋白極其少量表達(dá)，缺氧狀態(tài)下HIF-1α蛋白表達(dá)則顯著增多，可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性的綠色顆粒定位于細(xì)胞核；同時(shí)，常氧條件下A172細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)為弱陽(yáng)性。缺氧作用8、16和24 h后，VEGF蛋白表達(dá)量也明顯增強(qiáng)，可見(jiàn)棕紅色顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)，見(jiàn)圖2。

圖2 免疫熒光染色檢測(cè)缺氧培養(yǎng)后A172細(xì)胞HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)情況 (SP ×200)Figure2 Expression of HIF-1α and VEGF proteins in A172 cells cultured in hypoxia detected by immunofluorescence staining (SP ×200)

2.3 重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

結(jié)果表明，將重組質(zhì)粒Psilencer2.1 HIF-1α進(jìn)行測(cè)序分析，證實(shí)已將針對(duì)HIF-1α mRNA序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸雙鏈克隆入Psilencer2.1真核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，符合預(yù)期設(shè)計(jì)，能夠表達(dá)短發(fā)夾狀siRNA。

2.4 基因干預(yù)后VEGF mRNA表達(dá)水平的變化

以qPCR目的產(chǎn)物與內(nèi)參照的灰度值比值進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示：A172細(xì)胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒Psilencer2.1 HIF-1α之后（轉(zhuǎn)染組），缺氧培養(yǎng)24 h，細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)水平明顯受到抑制，抑制率為81.5%（P=0.033），而轉(zhuǎn)染陰性組（shRNAs-HIF（neg））與未轉(zhuǎn)染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 qPCR法檢測(cè)基因干預(yù)后A172細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)量變化Figure3 VEGF mRNA expression in A172 cells detected by qPCR after gene intervention

2.5 基因干預(yù)后對(duì)A172細(xì)胞HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)的影響

2.5.1 免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果

與未轉(zhuǎn)染組比較，轉(zhuǎn)染組缺氧處理24 h后，HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)顯著減少，而未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖4。

2.5.2 Western blot法檢測(cè)結(jié)果

基因干預(yù)后缺氧培養(yǎng)24 h，HIF-1α蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，與未轉(zhuǎn)染組灰度值比較其表達(dá)抑制率為86.3%（P=0.030），而未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染陰性組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)基因干預(yù)后A172細(xì)胞HIF-1α蛋白表達(dá)量變化Figure5 HIF-1α protein expression in A172 cells after gene intervention detected by Western blot

2.5.3 ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)相對(duì)量

未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白檢測(cè)吸光度值分別為：1.85±0.07、1.90±0.05和0.40±0.04，蛋白表達(dá)抑制率為78.9%（P=0.002），說(shuō)明轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)。

3 討論

圖4 免疫熒光染色檢測(cè)基因干預(yù)后A172細(xì)胞HIF-1α 、VEGF蛋白表達(dá)量變化 (SP×200)Figure4 Changes of HIF-1α and VEGF protein expression in A172 cells after gene intervention detected by immunof l uorescence staining (SP×200)

人腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)外科最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是血管化程度最高的實(shí)體腫瘤之一，其可呈浸潤(rùn)生長(zhǎng)，與正常腦組織界限不清難以完全切除，且對(duì)放、化療不敏感，極易復(fù)發(fā)，具有典型的“三高一低”（高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率、低治愈率）的特征[6]。目前膠質(zhì)瘤的臨床治療仍以外科手術(shù)結(jié)合放、化療的綜合治療為主，但治療效果并不理想，其中位生存期不超過(guò)一年[7]。隨著分子生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，生物靶向治療正逐步成為膠質(zhì)瘤治療的主要研究方向。作為生長(zhǎng)迅速的實(shí)體腫瘤，膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)到一定體積時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)便處于缺氧微環(huán)境，為了維持腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)，必須依賴(lài)新生血管的形成，抑制腫瘤血管生成則可有利于阻止腫瘤的生長(zhǎng)與侵襲轉(zhuǎn)移。因此，利用基因干預(yù)靶向抑制腫瘤血管生成治療或可為臨床膠質(zhì)瘤治療開(kāi)辟一條新途徑。

在血管生成的過(guò)程中，VEGF被認(rèn)為是一個(gè)最主要的調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究表明，缺氧環(huán)境中腫瘤細(xì)胞VEGF的合成可以增加十余倍。Liu等[8]研究最早表明缺氧導(dǎo)致腫瘤VEGF高表達(dá)，主要是通過(guò)一種被稱(chēng)為缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）的核轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)的。缺氧誘導(dǎo)因子自1992年發(fā)現(xiàn)至今，已被證實(shí)廣泛存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，為介導(dǎo)細(xì)胞缺氧環(huán)境下適應(yīng)性變化的細(xì)胞因子[9]，是一種DNA結(jié)合蛋白，是在所有缺氧轉(zhuǎn)錄過(guò)程中缺氧信息傳遞的共同通路[10]。HIF-1生物結(jié)構(gòu)上是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成，其中HIF-1α是其功能亞基，決定其轉(zhuǎn)錄活性的表達(dá)水平和穩(wěn)定性，其表達(dá)受氧分壓調(diào)控。氯化鈷模擬缺氧的機(jī)制是鈷可替代亞鐵螯合于血紅蛋白中，損傷細(xì)胞對(duì)氧的感受，能在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生類(lèi)似缺氧狀態(tài)，細(xì)胞對(duì)氯化鈷刺激和缺氧刺激具有相同的氧感受、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制，因此氯化鈷模擬的體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)缺氧狀態(tài)下的研究結(jié)果具有很強(qiáng)的可比性[11]。

缺氧是腫瘤微環(huán)境的一種病理生理特征，是腫瘤血管生成的主要刺激因子。對(duì)于HIF-1α激活的分子機(jī)制，雖然有部份學(xué)者認(rèn)為缺氧在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控HIF-1α[12]，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為缺氧是轉(zhuǎn)錄后蛋白水平對(duì)HIF-1α進(jìn)行調(diào)控，本研究結(jié)果顯示：在體外缺氧條件下，膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞HIF-1α mRNA水平的表達(dá)無(wú)論是缺氧還是常氧下差異無(wú)顯著性，而蛋白水平表達(dá)在缺氧后顯著提高，證明缺氧是在轉(zhuǎn)錄后蛋白水平對(duì)HIF-1α進(jìn)行調(diào)控的。

VEGF是促進(jìn)腫瘤血管生成的關(guān)鍵刺激因子，幾乎參與了腫瘤血管生成的每個(gè)環(huán)節(jié)[13]。VEGF是HIF-1α的下游調(diào)控基因，是促進(jìn)新生血管生成重要的細(xì)胞因子之一。VEGF自1989年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已被證實(shí)與血管生成密切相關(guān)，高度保守的同源二聚體糖蛋白，由兩條分子量各為24 kDa的單鏈以二硫鍵組成二聚體。VEGF分解的單體無(wú)活性，去除N2糖基對(duì)生物效應(yīng)無(wú)影響，但可能在細(xì)胞分泌中起作用。目前已知VEGF至少有VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF185、VEGF206五種蛋白形式，其中VEGF121、VEGF145、VEGF165是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖，增加血管通透性[14]。正常情況下VEGF表達(dá)狀態(tài)平衡，與其他相關(guān)因子共同調(diào)控血液供應(yīng)，惡性腫瘤高速生長(zhǎng)，導(dǎo)致內(nèi)部缺氧環(huán)境刺激HIF-1α表達(dá)，促進(jìn)VEGF表達(dá)上調(diào)，打破血管生成因子與抑制因子的平衡，使腫瘤血管增多。符黃德等[15]對(duì)VEGF的表達(dá)與腫瘤血管密度的相關(guān)性進(jìn)行了報(bào)道，本研究免疫熒光染色結(jié)果也證實(shí)：HIF-1α與VEGF的表達(dá)具有一致性。同時(shí)，qPCR和免疫熒光染色結(jié)果顯示：缺氧處理后VEGF在mRNA和蛋白水平的表達(dá)都有顯著提高，提示缺氧是促進(jìn)膠質(zhì)瘤中VEGF生成、腫瘤血管網(wǎng)新生的重要因素。膠質(zhì)瘤必然存在一種轉(zhuǎn)錄水平的激活機(jī)制來(lái)調(diào)控VEGF生成，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：HIF-1α蛋白水平表達(dá)明顯被抑制，抑制率達(dá)86.3%，基本達(dá)到基因抑制效果。同時(shí)通過(guò)qPCR和ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HIF-1α抑制后，A172細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)明顯抑制，抑制率為81.5%、VEGF蛋白表達(dá)水平也顯著下調(diào)。反過(guò)來(lái)說(shuō)明HIF-1α是通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活途徑參與缺氧誘導(dǎo)A172細(xì)胞VEGF的生成。

綜上所述，本文的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)：（1）與許多實(shí)體腫瘤一樣，膠質(zhì)瘤細(xì)胞也存在缺氧耐受的分子機(jī)制，提高了腫瘤在缺氧環(huán)境中的生存能力和新生血管的生成；（2）HIF-1α為調(diào)控VEGF分泌的重要因素，且是在蛋白表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。

目前，針對(duì)腫瘤的治療方法有不少報(bào)道，尤其是抑制VEGF基因表達(dá)的研究，作為抗血管生成基因治療，HIF-1α應(yīng)該是最佳基因位點(diǎn)之一[16]。但是腫瘤血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，調(diào)控因素甚多，尚需進(jìn)行深入研究以明確其他一些血管生成因子在腫瘤血管形成中的作用，以便于針對(duì)HIF-1α/VEGF通路的抗癌基因治療策略的實(shí)現(xiàn)。