李嵐，許斌綜述，查莉?qū)徯?/p>

0 引言

免疫治療發(fā)展迅速，在多種腫瘤類(lèi)型中都取得了重大突破，是一種前景廣闊的治療手段。但是，其在大多數(shù)實(shí)體瘤中有效率僅為20～30%[1]，而對(duì)于有效人群的篩選目前尚缺乏特異性手段。最常用的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物有細(xì)胞程序性死亡配體-1（programmed cell death ligand-1, PD-L1）表達(dá)水平、腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden,TMB）、高度衛(wèi)星不穩(wěn)定性或錯(cuò)配修復(fù)缺陷等[2-5]。腫瘤組織結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除了腫瘤細(xì)胞，也有基質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞、脈管系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)等，共同構(gòu)成腫瘤微環(huán)境[6]。研究顯示PD-L1表達(dá)量與免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效呈正相關(guān)，但未明確區(qū)分PD-L1表達(dá)的細(xì)胞來(lái)源，如腫瘤細(xì)胞還是免疫細(xì)胞或是腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞[7]。

腫瘤純度是指腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞所占的比例。研究顯示腫瘤純度與腫瘤患者的臨床特征、基因組表達(dá)和生物學(xué)特性均顯著相關(guān)，忽視腫瘤純度的影響可導(dǎo)致腫瘤基因分型、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及療效預(yù)測(cè)等過(guò)程產(chǎn)生系統(tǒng)性偏倚[8]，準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤純度有助于客觀分析腫瘤樣本。然而，目前極少有腫瘤分型、臨床研究、標(biāo)志物檢測(cè)等研究過(guò)程考慮了腫瘤純度的影響。非腫瘤細(xì)胞影響腫瘤純度，在腫瘤生物學(xué)中扮演重要的角色。本文主要從概念、計(jì)算方式及對(duì)基因組分析的影響三個(gè)方面介紹腫瘤純度。

1 腫瘤純度概念

臨床工作中獲得的腫瘤組織往往混合了非腫瘤細(xì)胞，其在腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展或耐藥等過(guò)程中具有重要作用，如基質(zhì)或間質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)并影響腫瘤治療反應(yīng)[9]，而免疫細(xì)胞如腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）可能抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。

腫瘤組織中腫瘤細(xì)胞所占的比例即為腫瘤純度。腫瘤純度很大程度上取決于腫瘤組織的獲取方式，標(biāo)準(zhǔn)的腫瘤手術(shù)標(biāo)本取樣純度通常低于70%。雖然癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)認(rèn)為60%的純度就足以區(qū)分腫瘤成分與非腫瘤成分，但是腫瘤純度會(huì)導(dǎo)致基于基因組分析的腫瘤研究結(jié)果產(chǎn)生系統(tǒng)性偏倚，對(duì)腫瘤純度進(jìn)行評(píng)估可以減少分析偏倚[11]。

2 腫瘤純度的計(jì)算

細(xì)胞分選技術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序可以用于確定腫瘤純度，但由于成本和技術(shù)的限制，不可能用于大規(guī)模研究。傳統(tǒng)的腫瘤純度計(jì)算方法是根據(jù)病理圖像分析來(lái)估計(jì)，往往受組織病理學(xué)、觀察者和試劑儀器精確度等各方面的影響。隨著基因組學(xué)、表觀遺傳組學(xué)、計(jì)算機(jī)及統(tǒng)計(jì)學(xué)等方面技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，已經(jīng)可以根據(jù)腫瘤樣本的基因表達(dá)、突變、拷貝數(shù)或甲基化數(shù)據(jù)分析計(jì)算腫瘤純度[12-14]。

2.1 經(jīng)典計(jì)算方法

（1）HE染色。通過(guò)蘇木精和伊紅染色劑載玻片的圖像分析來(lái)估計(jì)腫瘤純度。（2）白細(xì)胞去甲基化純度（leukocytes unmethylation for purity,LUMP）。根據(jù)44個(gè)非甲基化免疫特異性CpG位點(diǎn)平均值計(jì)算白細(xì)胞非甲基化程度，進(jìn)而估計(jì)腫瘤純度。（3）ABSOLUTE[13]。通過(guò)SNP array（基因芯片技術(shù)）測(cè)量體細(xì)胞拷貝變異數(shù)據(jù)，利用極大似然模型估計(jì)腫瘤純度，是一種直接測(cè)量樣本中的腫瘤細(xì)胞的計(jì)算方式。大多數(shù)TCGA樣本都采用ABSOLUTE方式計(jì)算腫瘤純度，被認(rèn)為是純度估計(jì)的金標(biāo)準(zhǔn)。（4）ESTIMATE[15]。利用單個(gè)樣本的基因富集分析以及免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜，推斷腫瘤樣本中基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)累計(jì)分布函數(shù)來(lái)估計(jì)腫瘤細(xì)胞純度。LUMP和ESTIMATE是通過(guò)測(cè)量樣本中免疫成分和基質(zhì)成分間接評(píng)估腫瘤純度，這兩種方法無(wú)法測(cè)量樣本中非免疫和基質(zhì)成分（如正常細(xì)胞）的存在，評(píng)估出的腫瘤純度較ABSOLUTE可能有差異。有研究者利用這四種方法計(jì)算出的腫瘤純度的中值作為腫瘤樣本純度。

2.2 新型計(jì)算方法

圖1 腫瘤樣本(A)及正常化樣本(B) 甲基化分布圖譜 [16]Figure1 Distribution of methylation level in tumor tissues(A) and normal control(B) [16]

（1）Zheng等[14]提出的統(tǒng)計(jì)算法MethylPurify是利用亞硫酸氫鹽來(lái)顯示差異甲基化區(qū)域，從而僅從單個(gè)腫瘤樣品推斷腫瘤純度，是第一種不需要正常細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞學(xué)基因組變異信息或其他信息進(jìn)行參照的方法，但是該方法需要足夠高的亞硫酸氫鹽的測(cè)序深度，價(jià)格昂貴，限制了其臨床應(yīng)用。（2）系統(tǒng)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中32種腫瘤類(lèi)型的450k甲基化芯片數(shù)據(jù)之后發(fā)現(xiàn)：與正常樣本相比，腫瘤樣本甲基化水平除了在0/1附近富集，在中間區(qū)域也出現(xiàn)了一個(gè)明顯的峰，腫瘤樣本在中間甲基化區(qū)域位點(diǎn)的比例更高，而這種現(xiàn)象正是由于腫瘤樣本“不純”導(dǎo)致，見(jiàn)圖1。InfiniumPurify則利用腫瘤樣本中與正常樣本甲基化差異顯著的位點(diǎn)，將其分為高甲基化組和低甲基化組，然后利用高斯核密度估計(jì)方法計(jì)算腫瘤樣本的純度。該方法估算出的腫瘤純度值與ESTIMATE、ABSOLUTE、LUMP、IHC等經(jīng)典方法得到的結(jié)果有較高的一致性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正常樣本個(gè)數(shù)大于或等于30時(shí)，腫瘤樣本純度估計(jì)與樣本的選擇無(wú)關(guān)[16-17]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的UiInfiniumPurify則利用腫瘤樣本和正常樣本通用的CpG位點(diǎn)估計(jì)腫瘤純度，可運(yùn)用于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)之外腫瘤樣本較少的腫瘤組織純度估計(jì)[18]。（3）AbsCN-seq是Bao等[19]開(kāi)發(fā)的一種簡(jiǎn)單穩(wěn)定的可根據(jù)全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)中評(píng)估腫瘤純度的算法。在NCI60細(xì)胞系、dbGAP、TCGA等數(shù)據(jù)庫(kù)中驗(yàn)證，與ABSOLUTE一致性良好，并且可與ABSOLUTE互補(bǔ)，用于對(duì)方不適用的情況。（4）PAMES（Purity Assessment from Clonal Methylation Sites）是Benelli等[20]開(kāi)發(fā)的利用高度克隆的腫瘤類(lèi)型特異性CpG位點(diǎn)的甲基化水平來(lái)估計(jì)腫瘤樣品純度的方法，不需要匹配正常對(duì)照，也不受腫瘤微環(huán)境的影響。在不同數(shù)據(jù)集的6 000多個(gè)樣本和腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行了驗(yàn)證評(píng)估，與其他方式的計(jì)算結(jié)果高度一致。并且研究者將PAMES的計(jì)算能力擴(kuò)展到利用CpG島進(jìn)行分析，而不僅限于特異性的CpG位點(diǎn)。（5）Sequenza是Favero等[21]開(kāi)發(fā)的利用配對(duì)的腫瘤DNA和正常細(xì)胞DNA外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)估計(jì)腫瘤純度的軟件。利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的30個(gè)腫瘤樣本的外顯子數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，Sequenza分析結(jié)果與等位基因特異性拷貝數(shù)函數(shù)分析SNP array的檢測(cè)結(jié)果高度一致，并且優(yōu)于AbsCN-seq、ABSOLUTE。此外，除了計(jì)算腫瘤純度，目前已構(gòu)建多種校正腫瘤純度的基因組分析統(tǒng)計(jì)模型，如差異表達(dá)分析、表達(dá)數(shù)量性狀基因座識(shí)別、聚類(lèi)分析等[22-24]。

3 腫瘤純度對(duì)基因組分析的影響

腫瘤純度是否代表生物學(xué)相關(guān)性和腫瘤內(nèi)在特征，或是僅僅代表外在特征（如手術(shù)切除和組織準(zhǔn)備）所決定的系統(tǒng)性偏倚仍存在爭(zhēng)議。（1）Aran等[8]評(píng)估了數(shù)百個(gè)臨床特征與腫瘤純度之間的相關(guān)性，但并未發(fā)現(xiàn)兩者之間有明確關(guān)聯(lián)，故認(rèn)為腫瘤純度差異很大程度上取決于外在因素。（2）Zhang等[25]針對(duì)腦膠質(zhì)瘤的分析表明純度較低的腫瘤惡性程度更高、預(yù)后更差，將腫瘤純度作為影響因子納入預(yù)測(cè)預(yù)后的列線(xiàn)圖中精確度顯著提高。不同純度的樣本基因組學(xué)特征也有所不同，低純度的膠質(zhì)瘤多具有7號(hào)染色體擴(kuò)增與10號(hào)染色體缺失（膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因組標(biāo)志），高純度的膠質(zhì)瘤多具有染色體1p19q共缺失（少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基因組標(biāo)志）。此外，低純度膠質(zhì)瘤免疫表型更強(qiáng)。（3）在結(jié)腸癌研究中也發(fā)現(xiàn)低腫瘤純度是預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，純度低的腫瘤突變負(fù)荷更高，免疫表型更強(qiáng)[26]。

腫瘤純度具有重要的臨床、基因組和生物學(xué)意義，是癌癥基因組或轉(zhuǎn)錄組分析的重要混雜因素。

3.1 對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)錄組分析的影響（以免疫相關(guān)基因?yàn)槔?/h3>

腫瘤組織混合了腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的RNA轉(zhuǎn)錄物，其中非腫瘤細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄物會(huì)影響腫瘤表達(dá)譜，使腫瘤轉(zhuǎn)錄組分析復(fù)雜化。Aran等[8]的研究表明腫瘤組織中正常細(xì)胞特別是免疫細(xì)胞的比例，可使遺傳分析或其他檢測(cè)的結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重偏差。免疫細(xì)胞是非腫瘤細(xì)胞主要成分之一，腫瘤組織中免疫相關(guān)基因的表達(dá)可能與其有關(guān)，因此腫瘤轉(zhuǎn)錄組分析尤其是側(cè)重于免疫相關(guān)基因的分析必須考慮腫瘤純度的問(wèn)題。腫瘤基因組的TMB和免疫治療相關(guān)靶基因的表達(dá)被認(rèn)為是免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效的可靠預(yù)測(cè)指標(biāo)，但是只有當(dāng)腫瘤組織中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度明確量化時(shí)，這些指標(biāo)用于預(yù)測(cè)檢查點(diǎn)抑制劑藥物有效性才是精確的。

Rhee等[11]從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得21種腫瘤類(lèi)型共7794例腫瘤標(biāo)本的RNA測(cè)序基因表達(dá)譜和腫瘤純度，計(jì)算個(gè)體基因表達(dá)和腫瘤純度的相關(guān)性，據(jù)此將基因分為與腫瘤純度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)兩組，并進(jìn)行基因富集分析以鑒定兩組基因的分子功能。結(jié)果顯示：與腫瘤純度負(fù)相關(guān)的基因中免疫相關(guān)基因持續(xù)富集，與腫瘤純度正相關(guān)的基因根據(jù)不同的分子功能富集。腫瘤純度較低的腫瘤樣本免疫細(xì)胞更多，突變負(fù)荷往往較高，因?yàn)槊庖呒?xì)胞引起的炎性反應(yīng)可以增加腫瘤細(xì)胞的突變率，免疫治療效果可能更佳[8]。有研究表示免疫相關(guān)基因的表達(dá)與突變負(fù)荷之間具有一定的相關(guān)性。粒酶A、穿孔素-1可代表腫瘤浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞活性，計(jì)算兩者表達(dá)的幾何平均值作為細(xì)胞溶解活性（cytolytic activity, CYT），研究顯示CYT與突變負(fù)荷顯著相關(guān)，與患者總生存率一定程度上相關(guān)[27]。然而，Rhee等發(fā)現(xiàn)CYT和突變負(fù)荷均與腫瘤純度顯著負(fù)相關(guān)，控制腫瘤純度之后，免疫相關(guān)基因與突變負(fù)荷的相關(guān)性降低，可能與腫瘤純度有關(guān)。進(jìn)一步研究在控制或不控制腫瘤純度時(shí)CYT和生存率之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，未控制腫瘤純度時(shí)，乳腺浸潤(rùn)癌、低級(jí)別膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌和皮膚黑色素瘤等多種腫瘤中都觀察到顯著相關(guān)，但在控制腫瘤純度之后，僅膀胱尿路上皮癌顯示CYT基因表達(dá)與患者存活率之間有顯著關(guān)聯(lián)。即CYT基因表達(dá)與生存率的相關(guān)性也可能是由腫瘤純度引起的。不同腫瘤類(lèi)型的CYT與生存關(guān)系的差異可能不能單純用腫瘤純度來(lái)解釋?zhuān)矐?yīng)將腫瘤純度作為臨床病理特征相關(guān)性分析，如患者免疫基因的表達(dá)與存活率的相關(guān)性分析中潛在的混雜因素。

免疫相關(guān)基因在與腫瘤純度呈負(fù)相關(guān)的基因中占主要部分，且無(wú)論腫瘤純度如何，免疫相關(guān)基因始終與腫瘤純度負(fù)相關(guān)。從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得免疫治療表達(dá)標(biāo)志物時(shí)需要考慮腫瘤純度。

3.2 對(duì)基因聚類(lèi)的影響

基因聚類(lèi)分析是將基因分為數(shù)類(lèi)，并使同一類(lèi)的基因盡可能相似，而不同類(lèi)的基因相似度很小。通過(guò)在分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上對(duì)腫瘤進(jìn)行分組的基因聚類(lèi)可對(duì)腫瘤進(jìn)行亞型分析，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療。腫瘤純度在多種腫瘤類(lèi)型中對(duì)基因共表達(dá)和基因聚類(lèi)有重要影響，大量基因?qū)υ诩兌日{(diào)整后失去了聚類(lèi)成員一致性，并且在不同腫瘤類(lèi)型中影響程度不盡相同[11]。

通過(guò)共表達(dá)基因?qū)梢园l(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)驅(qū)動(dòng)基因和與轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子通路，而有研究發(fā)現(xiàn)共表達(dá)基因?qū)Φ某霈F(xiàn)可能僅僅歸因于腫瘤純度。膀胱癌中JAK3和CSF1R為高水平共表達(dá)基因?qū)?，提示這兩個(gè)基因可能采取共同的機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)展。但如果考慮腫瘤純度，兩者共表達(dá)差異很大，純度高的腫瘤中兩者表達(dá)的相關(guān)性不大，因此這兩個(gè)基因在膀胱癌驅(qū)動(dòng)和轉(zhuǎn)移通路中是否具有聯(lián)合作用還有待確定，也突出了純度調(diào)整的必要性[8]。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在聚類(lèi)分析時(shí)，具有相似純度的腫瘤樣本傾向于分為一類(lèi)，如腫瘤純度較低的樣本，其甲基化譜與正常細(xì)胞甲基化譜更接近的傾向于分為一類(lèi)。Rhee等[11]將基因通過(guò)聚類(lèi)分析分配到六個(gè)基因簇中，基因?qū)Π凑帐欠駥儆谕淮胤譃榫垲?lèi)匹配對(duì)和聚類(lèi)不匹配對(duì)，然后分別在控制或不控制腫瘤純度時(shí)檢查了基因?qū)Φ木垲?lèi)成員。結(jié)果顯示在部分腫瘤類(lèi)型中，屬于同一簇的基因?qū)υ诳刂颇[瘤純度后55%以上將被分配到不同的簇。為進(jìn)一步驗(yàn)證校正基因純度的必要性，分別測(cè)量控制腫瘤純度前后聚類(lèi)匹配對(duì)和聚類(lèi)不匹配對(duì)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）基因?qū)Φ念l率。無(wú)論控制腫瘤純度與否，聚類(lèi)匹配對(duì)PPI基因?qū)︻l率均高于聚類(lèi)不匹配對(duì)，控制腫瘤純度前后聚類(lèi)匹配結(jié)果一致的基因?qū)χ蠵PI基因?qū)︻l率比不一致基因?qū)Ω?，純度調(diào)整可以增加基因聚類(lèi)的功能一致性。

3.3 對(duì)分子分類(lèi)的影響

利用特征基因作為基因分類(lèi)的標(biāo)志可對(duì)腫瘤進(jìn)行分子分類(lèi)，腫瘤純度可能影響該過(guò)程[28]。腫瘤純度在不同腫瘤亞型中有所不同，特征基因在不同腫瘤亞型和整體腫瘤中與腫瘤純度的相關(guān)性也不同。如840個(gè)特征基因?qū)CGA多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）分為四個(gè)亞型（前神經(jīng)元型、神經(jīng)元型、經(jīng)典型和間質(zhì)型），代表四個(gè)GBM亞型的特征基因與腫瘤純度顯著正相關(guān)（前神經(jīng)元型和經(jīng)典型）或負(fù)相關(guān)（神經(jīng)元型和間充質(zhì)型）[11]。而GBM特征基因?qū)φ嚓P(guān)或負(fù)相關(guān)的單一分布正好可以解釋Aran等[8]觀察到的整體GBM特征基因表達(dá)與腫瘤純度相關(guān)性的雙峰分布。進(jìn)一步使用與腫瘤純度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的部分特征基因進(jìn)行分層聚類(lèi)，發(fā)現(xiàn)主要在神經(jīng)元型和前神經(jīng)元型分子分類(lèi)中存在干擾。GBM的分子分類(lèi)學(xué)以及特征基因的選擇可能因腫瘤純度而有偏差[11]。類(lèi)似的其他研究也發(fā)現(xiàn)間質(zhì)腫瘤亞型的代表性表達(dá)信號(hào)主要?dú)w因于基質(zhì)細(xì)胞，而不是腫瘤細(xì)胞[29-30]。

3.4 對(duì)差異分析的影響

基因突變導(dǎo)致基因表達(dá)模式發(fā)生異常，這些差異表達(dá)的基因可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)差異分析也受腫瘤純度的影響。在不考慮腫瘤純度的情況下，對(duì)腫瘤免疫治療重要靶點(diǎn)CTLA-4和CD86蛋白的相對(duì)表達(dá)進(jìn)行差異分析的結(jié)果可能有偏倚[8]。此外，校正腫瘤純度的差異表達(dá)分析可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)差異表達(dá)分析不能檢測(cè)的免疫治療基因特征[8]。

4 展望

對(duì)腫瘤進(jìn)行基因組分析有助于增進(jìn)對(duì)腫瘤的理解，了解其發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，幫助腫瘤的早期診斷和治療，更是腫瘤精準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)。然而，腫瘤是一種復(fù)雜的微環(huán)境，除了腫瘤細(xì)胞還有其他多種細(xì)胞類(lèi)型，如正常細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、血管細(xì)胞等，腫瘤組織的不純會(huì)使遺傳分析及其他檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重偏差。腫瘤純度對(duì)基因組分析，包括基因轉(zhuǎn)錄組分析、基因聚類(lèi)、分子分類(lèi)和差異分析等各方面都有顯著影響，因此，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行分析時(shí)除了腫瘤細(xì)胞，也該關(guān)注非腫瘤細(xì)胞并建立合適的統(tǒng)計(jì)模型計(jì)算腫瘤純度，以校正腫瘤純度對(duì)基因組分析帶來(lái)的偏差。腫瘤純度的影響給腫瘤精準(zhǔn)治療帶來(lái)更多的挑戰(zhàn)與困難，希望將來(lái)有更多針對(duì)腫瘤組織的研究將腫瘤純度精確測(cè)量納入分析，以校正腫瘤純度的影響，準(zhǔn)確闡述腫瘤生物學(xué)的基本原理，為患者的精準(zhǔn)化個(gè)性醫(yī)療開(kāi)辟新的途徑。