劉士明，崔盼盼，丁濤，陳超，郭萌萌，徐林

0 引言

反義寡核苷酸技術(shù)（antisense oligonucleotides,ASOs）又稱反義技術(shù)，是指一種利用一段人工合成或表達(dá)的能與RNA或DNA互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸鏈，抑制目的基因表達(dá)的技術(shù)[1-2]，也可用于干擾腫瘤細(xì)胞中特定基因的表達(dá)，從而探討腫瘤發(fā)生的機(jī)制和開發(fā)基因的治療策略。近來研究顯示，微小RNA-21（miR-21）與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3-8]，可能是腫瘤基因治療的潛在新靶標(biāo)[9-10]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，通過ASOs可顯著下調(diào)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，并抑制腫瘤的生長[11]。本研究中進(jìn)一步利用人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞建立人結(jié)腸癌裸鼠實(shí)驗(yàn)動物模型，觀察ASOs下調(diào)miR-21的效果及對人結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)生長的效應(yīng)，為開發(fā)基于ASOs技術(shù)的人結(jié)腸癌基因治療策略提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、細(xì)胞株和主要試劑

12只雌性BALB/c裸鼠，4～5周齡，體質(zhì)量11～14 g左右，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動物許可證編號：SCXK（京）2011-0011]，于遵義醫(yī)學(xué)院SPF級免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)。人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購自中國生命科學(xué)院，重組質(zhì)粒p-miR-21-ASOs和對照質(zhì)粒p-Cont均由本實(shí)驗(yàn)室保存。McCoy's 5A培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自北京索萊寶科技有限公司，優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自美國Gibco公司，100×三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）購自上海第四制藥股份有限公司；SYBR Premix Ex Taq，Premix Ex Taq Version2.0以及RNAisoTMPlus均購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；miR-21探針試劑盒購自美國ABI公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒購自美國Fermentas公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根科技有限公司，0.5%Triton-X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）購自北京索萊寶科技有限公司；APC標(biāo)記的兔抗小鼠Ki-67單克隆抗體、DAPI染液均購自美國ThermoFisher公司；兔抗p-Akt、Akt一抗以及兔抗ERK1/2、p-ERK1/2一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司；全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物公司；ECL顯色液、RIPA裂解液、PVDF膜購自中國聯(lián)科生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 按如下條件培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株：人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株在10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、0.25 μg/ml兩性霉素B及11.9 g/L McCoy's 5A細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株置于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，待HCT116細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，使用0.25%胰蛋白酶37℃消化2 min，離心收集細(xì)胞，使用PBS重復(fù)清洗3次，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，利用PBS調(diào)整HCT116細(xì)胞密度為4.5×107個/毫升備用。

1.2.2 建立人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型 4～5周齡裸鼠購回后先于本實(shí)驗(yàn)室SPF級環(huán)境下觀察并飼養(yǎng)5～7 d。5～7 d天后小鼠飲食精神狀況良好，隨后接種100 μl密度為4.5×107個/毫升的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞于裸鼠右側(cè)腋窩外側(cè)中部皮下，荷瘤后繼續(xù)飼養(yǎng)并隨時觀察注射部位有無紅腫潰爛、裸鼠的飲食、精神情況以及每只裸鼠荷瘤成功后的成瘤時間。接種后5～7 d出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤包塊時，即為荷瘤裸鼠模型構(gòu)建成功。將實(shí)驗(yàn)荷瘤小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（p-miR-21-ASOs組）和對照組（p-Cont 組），每組6只，隨后每隔4 d分別向兩組荷瘤小鼠的腫瘤組織中注射100 μg p-Cont質(zhì)粒和p-miR-21-ASOs質(zhì)粒，共注射4次，并每隔3 d測量一次裸鼠皮下腫瘤體積。

1.2.3 觀察荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤生長情況 觀察方法同前期工作[11]。

1.2.4 免疫組織熒光法檢測腫瘤組織中Ki-67蛋白的表達(dá) 從-80℃超低溫冰箱取出用75%冰乙醇固定好的冰凍組織切片，室溫（15℃～25℃）平衡10 min，PBS緩沖液漂洗3次，每次5 min；山羊血清封閉液封閉1.5 h，PBS漂洗3次，每次10 min；加0.5%Triton-X-100，冰上破膜2 min，PBS漂洗3次，每次10 min；吸棄封閉液，滴加APC標(biāo)記的兔抗小鼠單克隆Ki-67抗體后置于濕盒內(nèi)，4℃冰箱避光過夜孵育，次日，取出冰凍切片腫瘤組織用PBS緩沖液漂洗3次，每次10 min；滴加DAPI染液，染色3 min，PBS漂洗3次，每次10 min；滴加含有DAPI染液的封片劑，封片并固定24 h后觀察；激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況，拍片。

1.2.5 實(shí)時熒光定量PCR檢測腫瘤組織中miR-21和腫瘤生長相關(guān)因子的表達(dá) 腫瘤組織中miR-21、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin- dependent kinase, CDK）表達(dá)的檢測同前期工作[11]。

1.2.6 Western blot檢測Akt、ERK1/2、磷酸化Akt、磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá) 蛋白樣品的制備及BCA法定量蛋白的檢測同前期工作[11]。Western blot檢測相關(guān)信號通路的變化：（1）電泳：分離膠10%，積層膠5%，80 V跑積層膠，120 V跑分離膠；（2）上樣：第一泳道Marker，其余泳道加提取的總蛋白；（3）轉(zhuǎn)膜：PVD膜，36 V，180 min電轉(zhuǎn)；（4）洗膜：用TBS或者PBS洗膜；5 min一次；（5）封閉：用含5%脫脂奶粉的TBST或者PBST封閉1 h；（6）加一抗：加入相關(guān)目的蛋白的一抗（稀釋比例均為1:2 000），4℃過夜；（7）洗膜：次日用TBST或者PBST洗膜，10 min三次；（8）加二抗：加入HRP標(biāo)記的相關(guān)目的蛋白的二抗（稀釋比例均為1:2 000），室溫孵育1 h；（9）用PBST洗膜，10 min×3次；（10）用發(fā)光試劑（ECl）對膜進(jìn)行處理，于發(fā)光儀上進(jìn)行蛋白曝光檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究中各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果以（x±s）表示。其中組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-miR-21-ASOs重組質(zhì)粒注射后各組裸鼠荷瘤模型中腫瘤的生長變化

結(jié)果顯示，與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組皮下腫瘤生長顯著延緩，且腫瘤組織的體積、大小、重量都明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。

2.2 腫瘤組織病理學(xué)改變

HE染色顯示：p-Cont組腫瘤細(xì)胞形態(tài)不一，細(xì)胞核深染且核呈多形性，核質(zhì)比加大；而p-miR-21-ASOs組則可見腫瘤組織大面積壞死，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒局部注射荷瘤裸鼠后腫瘤組織HE染色結(jié)果(×400)Figure2 HE staining results of tumor tissues after local injection of recombinant plasmid into xenograft tumor in nude mice (×400)

2.3 p-miR-21-ASOs重組質(zhì)粒注射后腫瘤組織中miR-21成熟體的表達(dá)

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組腫瘤組織中miR-21的表達(dá)水平顯著下調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 Real-time PCR 探針法檢測腫瘤組織中miR-21的表達(dá)Figure3 Expression of miR-21 in tumor tissues detected by real-time PCR

2.4 免疫熒光技術(shù)檢測腫瘤組織中細(xì)胞的增殖

免疫熒光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)：相比于p-Cont組，p-miR-21-ASOs組腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)水平明顯減少（P＜0.01），見圖4。

2.5 p-miR-21-ASOs重組質(zhì)粒注射后周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組腫瘤細(xì)胞生長周期相關(guān)的周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK3、CDK4以及CDK6的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05, P＜0.001），見圖5。

2.6 Western blot檢測腫瘤組織中相關(guān)信號通路的表達(dá)

結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-miR-21-ASOs組中p-ERK1/2，p-Akt的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05, P＜0.01），見圖6。

3 討論

近來的研究發(fā)現(xiàn)，ASOs技術(shù)可廣泛用于多種臨床疾病發(fā)生機(jī)制探討和治療策略開發(fā)[12-18]。對于腫瘤基因治療來說，利用ASOs技術(shù)干預(yù)特定基因表達(dá)來影響腫瘤生長方面的研究也取得了重要進(jìn)展[19-20]。我們在新近工作中也發(fā)現(xiàn)利用真核載體過表達(dá)ASOs干預(yù)miR-21表達(dá)可顯著抑制人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的體內(nèi)生長[11]。本研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，真核載體過表達(dá)ASOs也可有效抑制人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，同時腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長受到抑制。范鈺等[21]用ASOs下調(diào)人喉癌Hep-2細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲能力明顯減弱。吳子晏等[22]研究發(fā)現(xiàn)ASOs干預(yù)miR-21聯(lián)合順鉑在體內(nèi)、外能顯著抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，顯示了一定的治療效應(yīng)。這些研究結(jié)果提示，利用ASOs技術(shù)干預(yù)miR-21表達(dá)可能是一種能有效影響特定腫瘤生長的手段，為后續(xù)開發(fā)基于ASOs的人結(jié)腸癌基因治療策略提供了重要工作基礎(chǔ)。

圖1 重組質(zhì)粒注射后裸鼠皮下種植瘤的腫瘤體積(A)、大小(B)和重量(C)變化Figure1 Tumor volume(A), size(B) and weight(C) in nude mice after subcutaneous injection of recombinant plasmid

圖4 p-miR-21-ASOs重組質(zhì)粒注射荷瘤裸鼠后激光共聚焦檢測腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)Figure4 Expression level of Ki-67 protein after injection of p-miR-21-ASOs recombinant plasmid into xenograft tumor in nude mice detected by immunof l uorescence technique

圖5 實(shí)時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織中CDKs的表達(dá)Figure5 Expression of CDKs in tumor tissues detected by real-time fl uorescent quantitative PCR

研究顯示，miR-21可通過對多種靶分子和信號途徑傳遞的調(diào)節(jié)來調(diào)控人結(jié)腸癌的生長[23-28]。在前期工作中，我們也發(fā)現(xiàn)ASOs下調(diào)miR-21表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)信號途徑Akt和ERK1/2明顯改變，與其靶分子PTEN的表達(dá)變化有關(guān)[4,10]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ASOs下調(diào)miR-21表達(dá)后，腫瘤組織存在壞死，腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯減弱，同時，腫瘤組織中p-Akt和p-ERK1/2等蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，進(jìn)一步提示了miR-21對Akt和ERK1/2等信號途徑的調(diào)控作用。現(xiàn)已知，細(xì)胞內(nèi)CDKs家族分子的表達(dá)改變與腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)CDKs家族成員表達(dá)水平顯著減低。鑒于已有的研究表明，腫瘤細(xì)胞生長相關(guān)信號途徑Akt和ERK1/2與細(xì)胞內(nèi)CDKs家族成員表達(dá)間存在密切聯(lián)系[29-31]。因此，推測ASOs干預(yù)miR-21表達(dá)后對人結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)生長的抑制效應(yīng)機(jī)制，包括腫瘤組織壞死的變化，與Akt和ERK1/2等信號途徑傳遞改變，進(jìn)而影響CDKs家族分子的表達(dá)有關(guān)。然而，鑒于不同實(shí)驗(yàn)條件的差異性，ASOs下調(diào)miR-21后抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞體內(nèi)生長的確切分子機(jī)制仍有待后續(xù)研究闡明。

圖6 Western blot檢測腫瘤組織中總Akt、ERK1/2和Akt、ERK1/2磷酸化的水平Figure6 Expression levels of total Akt, ERK1/2, p-Akt and p-ERK1/2 in tumor tissues analyzed by Western blot

總之，本研究發(fā)現(xiàn)ASOs可顯著下調(diào)人結(jié)腸癌動物模型中腫瘤組織miR-21的表達(dá)，同時腫瘤體內(nèi)生長受到明顯抑制，該效應(yīng)與Akt和ERK1/2等信號途徑傳遞變化有關(guān)，為后續(xù)深入探討miR-21調(diào)控腫瘤生長的分子機(jī)制，以及開發(fā)基于ASOs技術(shù)的人結(jié)腸癌基因治療策略提供前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。