王 倩， 袁莉莉， 范文濤

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)， 咸陽 712046)

結(jié)直腸癌是發(fā)生于結(jié)腸或直腸粘膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位。據(jù)流行病學(xué)資料表明，該病的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡可見于任何年齡，以40～50歲年齡組發(fā)病率最高，目前已成為嚴(yán)重威脅人類健康的常見疾病。只有做到早發(fā)現(xiàn)、早治療才能有效降低死亡率。本文通過GEO數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，篩選結(jié)直腸癌差異基因，分析生存曲線，為早期診斷結(jié)直腸癌提供新的標(biāo)志物及其治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)庫芯片篩選

本研究通過檢索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),選擇GEO Datasets，檢索Colorectal cancer，選擇Homo sapiens ，共檢索出27723芯片。選擇GSE21510，包含104例樣本；GSE25071，包含50例樣本；GSE32323，包含10例樣本。3組共納入164例樣本。

1.2 差異基因篩選

進(jìn)入芯片數(shù)據(jù)庫，選擇GEO數(shù)據(jù)庫自帶分析工具Analyze with GEO2R，點(diǎn)擊Define groups進(jìn)行分組，分為癌組織組和癌旁組織組，點(diǎn)擊TOP250進(jìn)行分析，保存分析數(shù)據(jù)。進(jìn)一步根據(jù)P值<0.01，logFC>2或者<-2進(jìn)行差異基因篩選。

1.3 繪制文恩圖

將檢索出的差異基因采用文恩圖制作軟件(venny2.1)繪制文恩圖，查找三組共有基因。

1.4 差異基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)

打開TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov/)，用差異基因查找在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。

1.5 生存曲線分析

打開TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov/)，分析差異基因?qū)Y(jié)直癌生存曲線的影響。

1.6 驗(yàn)證

將篩選出的差異基因，在GEO 數(shù)據(jù)庫GSE24514芯片集中進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 GSE21510基因芯片差異基因分析結(jié)果

進(jìn)入芯片數(shù)據(jù)庫，使用GEO數(shù)據(jù)庫自帶分析工具Analyze with GEO2R，點(diǎn)擊Define groups進(jìn)行分組，分為癌組織組和癌旁組織組，點(diǎn)擊TOP250進(jìn)行分析，保存分析數(shù)據(jù)。進(jìn)一步根據(jù)P值<0.01，logFC>2或者<-2進(jìn)行差異基因篩選。共篩選出251個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因146個(gè)，下調(diào)基因105個(gè)。繪制差異基因火山圖(圖1)。

2.2 GSE25071基因芯片差異基因分析結(jié)果

進(jìn)入芯片數(shù)據(jù)庫，使用GEO數(shù)據(jù)庫自帶分析工具Analyze with GEO2R，點(diǎn)擊Define groups進(jìn)行分組，分為癌組織組和癌旁組織組，點(diǎn)擊TOP250進(jìn)行分析，保存分析數(shù)據(jù)。進(jìn)一步根據(jù)P值<0.01，logFC>2或者<-2進(jìn)行差異基因篩選。共篩選出669個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因312個(gè)，下調(diào)基因357個(gè)。繪制差異基因火山圖(圖2)。

Fig.1Analysis of GSE21510 gene chip differential genes

Fig.2Analysis of GSE25071 gene chip differential genes

2.3 GSE32323基因芯片差異基因分析結(jié)果

進(jìn)入芯片數(shù)據(jù)庫，使用GEO數(shù)據(jù)庫自帶分析工具Analyze with GEO2R，點(diǎn)擊Define groups進(jìn)行分組，分為癌組織組和癌旁組織組，點(diǎn)擊TOP250進(jìn)行分析，保存分析數(shù)據(jù)。進(jìn)一步根據(jù)P值<0.01，logFC>2或者<-2進(jìn)行差異基因篩選。共篩選出353個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因115個(gè)，下調(diào)基因238個(gè)。繪制差異基因火山圖(圖3)。

Fig.3Analysis of GSE32323 gene chip differential genes

2.4 GSE21510、GSE2507、GSE32323芯片差異基因文恩圖分析

經(jīng)篩選GSE21510基因芯片差異基因251個(gè)，其中上調(diào)基146個(gè)，下調(diào)基因105個(gè)。GSE25071基因芯片差異基因669個(gè)，其中上調(diào)基因312個(gè)，下調(diào)基因357個(gè)。GSE32323基因芯片差異基因353個(gè)，其中上調(diào)基因115個(gè)，下調(diào)基因238個(gè)。經(jīng)文恩圖分析，3個(gè)基因集交集共有15個(gè)基因，其中上調(diào)基因3個(gè)，下調(diào)基因12個(gè)(圖4)。在結(jié)腸癌組織中上調(diào)基因?yàn)榇侔┗?，下調(diào)基因?yàn)橐职┗颉Ｍㄟ^基因的差異表達(dá)和生存曲線分析，分別在已篩選的促癌基因和抑癌基因種尋找結(jié)直腸癌診斷標(biāo)志物。

Fig.4Analysis of genetic differences Venn diagram

Tab. 1 Three lists of differential genes

2.5 篩選出差異基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)

打開TCGA數(shù)據(jù)庫，用差異基因查找在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。上調(diào)基因3個(gè)，下調(diào)基因12個(gè)。

2.5.1 上調(diào)基因 在TCGA數(shù)據(jù)庫分析包含327例結(jié)直腸癌標(biāo)本的數(shù)據(jù)集，分析差異基因表達(dá)。286例患者INHBA、NFE2L3、HOMER1基因表達(dá)明顯上調(diào)，41例正常。表明上調(diào)基因?qū)Y(jié)直腸的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用(圖5)。

Fig.5Upregulated gene expressions in TCGA database

2.5.2 下調(diào)基因 在TCGA數(shù)據(jù)庫分析包含327例結(jié)直腸癌標(biāo)本的數(shù)據(jù)集，分析差異基因表達(dá)。286例患者CA4、CLCA4、BEST4、CA1、CPM、ENTPD5、PDE9A、SLC4A4、SPIB、VSIG2、ZG16、ADH1B基因表達(dá)明顯下調(diào)，41例正常。表明下調(diào)基因?qū)Y(jié)直腸的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用(圖6)。

2.6 差異基因在TCGA數(shù)據(jù)庫中生存曲線

在TCGA數(shù)據(jù)庫分析包含279例結(jié)直腸癌標(biāo)本的數(shù)據(jù)集，對(duì)差異基因進(jìn)行生存分析。發(fā)現(xiàn)70例INHBA基因升高患者的生存時(shí)間明顯低于209例INHBA基因減低患者，說明INHBA基因升高對(duì)結(jié)直腸癌具有促進(jìn)作用。71例CLCA4、CA4基因升高患者的生存時(shí)間明顯高于208例CLCA4、CA4基因降低患者，說明CLCA4、CA4基因升高對(duì)結(jié)直腸癌具有抑制作用(圖7)。

Fig.6The expressions of down-regulated genes in TCGA database

Fig.7Differential gene survival curves

2.7 GEO數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證

在GEO數(shù)據(jù)庫中查找結(jié)直腸癌相關(guān)GSE24514芯片集，共包含49例標(biāo)本，使用工具Analyze with GEO2R進(jìn)行在線分析，查找差異基因ID。通過ID號(hào)查找到差異基因在組織中的表達(dá)量，驗(yàn)證促癌基因INHBA，抑癌基因CLCA4、CA4在芯片集中的表達(dá)量。

2.7.1 促癌基因 促癌基因INHBA在GEO數(shù)據(jù)庫GSE24514結(jié)直腸癌芯片集49例樣本中(圖8)， 34例腫瘤樣本成高表達(dá)，明顯高于15例正常組織樣本。表明基因INHBA在結(jié)直腸癌形成過程中起到促進(jìn)作用。

Fig.8Differential expression of INHBA gene in GSE24514 dataset

2.7.2 抑癌基因 抑癌基因CLCA4、CA4在GEO數(shù)據(jù)庫GSE24514結(jié)直腸癌芯片集49例樣本中(圖9、10)， 34例腫瘤樣本成低表達(dá)，明顯低于15例正常組織樣本。表明基因CLCA4、CA4在結(jié)直腸癌形成過程中起到抑制作用。

Fig.9Differential expression of CLCA4 and CA4 genes in GSE24514 dataset

Fig.10Differential expression of CLCA4 and CA4 genes in GSE24514 dataset

3 討論

結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，主要發(fā)生在人體消化系統(tǒng)直腸和乙狀結(jié)腸，是由直腸和乙狀結(jié)腸發(fā)生癌變導(dǎo)致的，發(fā)病率較高，主要發(fā)生群體是40～50的年齡人群，男性大于女性。結(jié)腸癌初期癥狀不明顯，容易被人忽略，一般發(fā)現(xiàn)在中后期，有消化不良、排便不暢、貧血、消瘦等癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)便血、粘液膿性血便中毒。因不能早期發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致死亡率較高。因此，篩選結(jié)直腸癌促癌、抑制基因，有利于早期診斷治療。

本研究通過篩選GSE21510基因芯片得到差異基因251個(gè)，其中上調(diào)基因146個(gè)，下調(diào)基因105個(gè)。GSE25071基因芯片差異基因669個(gè)，其中上調(diào)基因312個(gè)，下調(diào)基因357個(gè)。GSE32323基因芯片差異基因353個(gè)，其中上調(diào)基因115個(gè)，下調(diào)基因238個(gè)。經(jīng)文恩圖分析，3個(gè)基因集交集共有15個(gè)基因，其中上調(diào)基因3個(gè)，下調(diào)基因12個(gè)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中查找差異基因的表達(dá)量和生存曲線。根據(jù)基因表達(dá)量及生存曲線，篩選出上調(diào)基因INHBA為促癌基因，下調(diào)基因CLCA4、CA4為抑癌基因。為進(jìn)一步驗(yàn)證3個(gè)基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。本文再選取GEO數(shù)據(jù)庫GSE24514芯片驗(yàn)證差異基因在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。促癌基因INHBA在GSE24514芯片癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，表明INHBA基因具有促進(jìn)結(jié)直腸癌變的作用。抑癌基因CLCA4、CA4在GSE24514芯片癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，表明CLCA4、CA4基因?qū)Y(jié)直腸癌有抑制作用。

有報(bào)道在食管腺癌中，INHBAmRNA 水平顯著高于Barrett 食管及食管上皮異性增生[1]。在胃癌中，腫瘤組織中 INHBAmRNA 水平亦顯著高于癌旁正常組織[2]。Wang 等[2]的研究認(rèn)為，胃癌中INHBA mRNA 高表達(dá)與瘤體較大及瘤體浸潤較深相關(guān)，同時(shí) INHBA 高表達(dá)患者的無瘤生存期及總體生存期均顯著低于低表達(dá)者。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中，INHBA 過表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且高表達(dá)者無病生存期顯著低于低表達(dá)者[1]。研究顯示，在食管腺癌中INHBA基因啟動(dòng)子去甲基化導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖[3]。INHBA 基因在肺腺癌[4]、胃癌[5]、結(jié)直腸癌[6]等惡性腫瘤中也存在顯著表達(dá)上調(diào)，并且其高表達(dá)與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究顯示TGF-β、NF-κB 等信號(hào)通路相關(guān)基因在右半結(jié)腸癌組織中顯著富集，TGF-β通路中的差異表達(dá)基因INHBA 在右半結(jié)腸癌組織中的mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著高于左半結(jié)腸癌，并且INHBA 高表達(dá)與脈管浸潤、血管壁浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后呈正相關(guān)，提示INHBA 基因可能在右半結(jié)腸癌的發(fā)生和演進(jìn)過程中發(fā)揮著重要作用，有望為右半結(jié)腸癌患者的臨床治療提供新的分子靶點(diǎn)[7]。

CLCA4 在 CRC 細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的表達(dá)水平顯著低于正常對(duì)照組織，在疾病不同階段的患者還表現(xiàn)出極大的差異，并和患者的生存期顯著關(guān)聯(lián)。這表明 CLCA4 表達(dá)降低可能是惡性腫瘤的生物標(biāo)志物并參與癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，如果早期檢測(cè)該標(biāo)志物，可以預(yù)測(cè)患者預(yù)后并作為治療干預(yù)的判斷依據(jù)。CLCA4 和CLCA1 的表達(dá)缺失可以降低對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制[8]。研究發(fā)現(xiàn)CLCA4 的表達(dá)與腫瘤的高風(fēng)險(xiǎn)因素緊密相關(guān)，如原發(fā)腫瘤的浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes 分期和組織學(xué)分級(jí)，并且表達(dá)水平隨腫瘤的分化程度逐步變化，這可能表示在早期 CRC 患者中檢測(cè)該指標(biāo)可直接預(yù)知該患者的預(yù)后情況是否良好。另外，檢測(cè) CLCA4的表達(dá)也可能有助于識(shí)別患者預(yù)后較差的風(fēng)險(xiǎn)因素，以此來評(píng)估 CLCA4 水平有助于準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)患者的預(yù)后、復(fù)發(fā)和潛在的二次性手術(shù)的幾率，這樣可以個(gè)體化的治療每個(gè)病人，達(dá)到優(yōu)化治療的效果[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌標(biāo)本中基因INHBA(促癌基因)明顯升高，基因 CA4、CLCA4(抑癌基因)明顯降低。 生存曲線證實(shí)INHBA基因升高患者的生存時(shí)間明顯低于INHBA基因減低患者，說明INHBA基因升高對(duì)結(jié)直腸癌具有促進(jìn)作用。CLCA4、CA4基因升高患者的生存時(shí)間明顯高于208例CLCA4、CA4基因降低患者，說明CLCA4、CA4基因升高對(duì)結(jié)直腸癌具有抑制作用。通過GEO數(shù)據(jù)庫與TCGA數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌促癌基因INHBA，抑癌基因CLCA4、CA4?；騃NHBA、CLCA4、CA4在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)揭示了其在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。有望成為檢測(cè)結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的重要手段。