王英新，劉 玲，李樹(shù)英，蘭 頤，聶 磊

(1山東大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 250012；2山東達(dá)因海洋生物制藥股份有限公司，榮成 264300)

白三烯為引發(fā)哮喘的重要炎性介質(zhì)，其在哮喘患兒氣道中存在，可增加哮喘患兒呼吸道血管通透性，導(dǎo)致支氣管黏膜水腫和平滑肌收縮，促進(jìn)黏液栓形成，可導(dǎo)致支氣管阻塞加重，引發(fā)哮喘發(fā)作。孟魯司特鈉為選擇性白三烯受體拮抗劑，其與白三烯受體具有良好的親和力，用藥后可與白三烯競(jìng)爭(zhēng)受體，對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行抑制，從而發(fā)揮抗炎和抗哮喘作用。孟魯司特鈉適用于成人和兒童哮喘的預(yù)防和長(zhǎng)期治療，包括預(yù)防白天和夜間的哮喘癥狀；能夠緩解哮喘急性發(fā)作，減少激素用量，提高患兒用藥的依從性[1]；也適用于治療對(duì)阿司匹林敏感的哮喘患者及預(yù)防運(yùn)動(dòng)引起的支氣管收縮，具有良好的臨床效果[2-3]。

孟魯司特鈉顆粒劑為兒童哮喘預(yù)防和治療的常用藥，但目前尚未見(jiàn)關(guān)于孟魯司特鈉顆粒雜質(zhì)譜與雜質(zhì)來(lái)源詳細(xì)解析的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。有關(guān)物質(zhì)作為藥品質(zhì)量的重要屬性，關(guān)系用藥安全，同時(shí)明確雜質(zhì)種類(lèi)與產(chǎn)生途徑對(duì)制劑工藝開(kāi)發(fā)與產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義。因此，本文采用HPLC-MS/MS對(duì)市售孟魯司特鈉顆粒(順爾寧，規(guī)格4 mg)的雜質(zhì)譜進(jìn)行了研究，探究了其雜質(zhì)譜中各雜質(zhì)的來(lái)源與生成途徑，以期對(duì)該品種的制備工藝制定及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考和指導(dǎo)。

1 材 料

1.1 試劑與藥品

孟魯司特鈉顆粒(順爾寧?，規(guī)格4 mg；美國(guó)Merck sharp & Dohme公司，批號(hào)0000522303與0000546722)；孟魯司特鈉EP雜質(zhì)對(duì)照品均購(gòu)自加拿大Molcan公司：雜質(zhì)對(duì)照品B(批號(hào)121107，含量97.6%)、雜質(zhì)對(duì)照品C(批號(hào)121016，含量91.9%)、雜質(zhì)對(duì)照品D(批號(hào)121008，含量95.3%)、雜質(zhì)對(duì)照品E(批號(hào)121018，含量96.7%)、雜質(zhì)對(duì)照品G(批號(hào)121014，含量90.1%)；孟魯司特鈉原料(牡丹江恒遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，批號(hào)150801)。甲醇、乙腈、三氟乙酸為色譜純，水為超純水(電阻系數(shù)≥18.2 MΩ·cm，本實(shí)驗(yàn)室制備)。

1.2 儀 器

高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司，包含1290高效液相色譜儀、6460 Triple Quad LC/MS質(zhì)譜、Mass Hunter工作站)。

2 方 法

2.1 檢測(cè)條件

色譜條件：菲羅門(mén)苯基-己基柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相A：0.15%三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相B：0.15%三氟乙酸乙腈；梯度洗脫流動(dòng)相A比例變化：0～10 min 為60%，10～25 min由60%～32%，并保持32%至40 min，40.1 min變更為60%，并持續(xù)至45 min；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源，正離子化，噴霧電壓4 000 V，霧化器壓力50 psi(1 psi=6.895 kPa)，毛細(xì)管溫度350 ℃，碰撞氣為高純氮?dú)?，碰撞電?0 eV。

2.2 樣品制備

供試品溶液(避光操作)：稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當(dāng)于孟魯司特鈉25 mg)研細(xì)，置50 mL量瓶中，加甲醇-水(9∶1)的混合溶液，振搖使溶解，0.45 μm濾膜過(guò)濾即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，光照約5 min，生成孟魯司特鈉順式異構(gòu)體，得系統(tǒng)適用性溶液。精密量取20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，順式異構(gòu)體與孟魯司特鈉的分離度不小于2.5。

3 結(jié) 果

3.1 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定與雜質(zhì)對(duì)照品定位

采用HPLC-VWD(紫外可見(jiàn)檢測(cè)器)法檢測(cè)孟魯司特鈉顆粒樣品的有關(guān)物質(zhì)雜質(zhì)譜，并使用孟魯司特鈉EP雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行色譜保留時(shí)間定位，定位結(jié)果如圖1所示。

Figure1 Montelukast sodium granule related substances and impurity references positioning

A:Montelukast sodium granule impurity spectrum;B:Montelukast+ impurity references (B-G)

在孟魯司特鈉顆粒中檢測(cè)出7種有關(guān)物質(zhì)(編號(hào)1～7)，其中有關(guān)物質(zhì)1、3、4、5、6的保留時(shí)間分別與孟魯司特鈉EP雜質(zhì)對(duì)照品C、G、E、D、B一致,可能對(duì)應(yīng)為同種物質(zhì)，進(jìn)而采用質(zhì)譜法進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定確認(rèn)。

3.2 雜質(zhì)鑒定

采用HPLC-MS/MS法測(cè)定了孟魯司特鈉顆粒有關(guān)物質(zhì)1～7及孟魯司特鈉EP雜質(zhì)對(duì)照品(B、C、D、E、G)的分子離子([M+H]+)與二級(jí)碎片離子信息，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1與圖2。

Table1 Mass spectra results of montelukast sodium related substances

Compd.t/min[M+H]+(m/z)Secondaryfragmention(m/z+)References/MMontelukast20.1586——19.9602440,472,584C/601.21210.8602440,472,584—317.8586422,440,568G/585.21419.1732311,343,456,586E/731.25519.3732311,343,453,569D/731.25625.6568—B/567.20726.9602131,157,294,438—

Figure2 Mass spectra of montelukaste sodium releated substance (A-H)

A：Impurity1;B：Impurity2;C：Impurity3product ion;D：Impurity4;E：Impurity5;F：Impurity6;G：Impurity7;H：Impurity7product ion

測(cè)定結(jié)果表明，孟魯司特鈉顆粒中的有關(guān)物質(zhì)1、3、4、5、6的分子離子與二級(jí)碎片離子分別與孟魯司特鈉EP雜質(zhì)對(duì)照品C(亞砜)、G(順式異構(gòu)體)、E(邁克爾加成物2)、D(邁克爾加成物1)、B(甲基苯乙烯)一致,可以確定其分別對(duì)應(yīng)為同一物質(zhì)；雜質(zhì)2與7的相對(duì)分子質(zhì)量較孟魯司特大16，推測(cè)此二者為孟魯司特的氧化產(chǎn)物(分子內(nèi)增加1個(gè)氧原子)，在孟魯司特分子中硫原子與氮原子可被氧化,產(chǎn)物分別為含亞砜與喹啉環(huán)氮氧化物結(jié)構(gòu)的化合物。查閱文獻(xiàn)，歐洲藥典8.0、美國(guó)藥典40表明EP雜質(zhì)C(亞砜)存在立體異構(gòu)體，共存的異構(gòu)體在色譜上呈現(xiàn)為相鄰的雙峰[4-5]，雜質(zhì)2在相對(duì)分子質(zhì)量與色譜行為上滿足以上特征，因此判定雜質(zhì)2是雜質(zhì)1(亞砜)的異構(gòu)體。假定雜質(zhì)7為喹啉環(huán)氮氧化物，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行二級(jí)碎片離子解析，結(jié)果表明假定與實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的吻合度(圖3)，表明雜質(zhì)7較可能為喹啉環(huán)氮氧化物，該雜質(zhì)未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

3.3 雜質(zhì)來(lái)源分析

從孟魯司特鈉(原料)的合成工藝、強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)及制劑工藝等方面進(jìn)行分析，以明確孟魯司特鈉顆粒雜質(zhì)1～7的來(lái)源途徑。

3.3.1 原料合成工藝雜質(zhì)分析 孟魯司特鈉原料與顆粒均由默克公司研制，孟魯司特鈉合成路線[6]如圖4所示，結(jié)合“3.2”項(xiàng)中對(duì)雜質(zhì)1～7的鑒定結(jié)果，判定雜質(zhì)4、5、6應(yīng)來(lái)源于合成工藝，雜質(zhì)4、5為孟魯司特鈉母核分子中雙鍵發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)生成，雜質(zhì)4和5的生成途徑見(jiàn)圖5；雜質(zhì)6為甲基磺酰氯(MeSO2Cl)進(jìn)攻分子中多余的羥基生成的副產(chǎn)物，雜質(zhì)6的生成途徑見(jiàn)圖6。

Figure3 Structure analysis of impurity7

Figure4 Synthesis pathway of montelukast sodiums

Figure5Formation route of impurities4and5

Figure6Formation route of impurity6of montelukast sodium

3.3.2 孟魯司特鈉降解雜質(zhì)分析 根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研信息[7]與“3.2”項(xiàng)中雜質(zhì)鑒定結(jié)果，雜質(zhì)1、2、3、7應(yīng)為降解產(chǎn)物。取孟魯司特鈉顆粒，分別進(jìn)行酸、堿、氧化、光照與高溫破壞，確認(rèn)雜質(zhì)1、2、3、7的降解途徑。

氧化降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當(dāng)于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液5 mL，加30%過(guò)氧化氫溶液2 mL，室溫避光放置10 min，加混合溶液定容，搖勻，即得。

光降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當(dāng)于原料25 mg)，置50 mL無(wú)色透明量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液約30 mL，超聲1 min，置5 500 lx光照強(qiáng)度下照射約3.5 h，取出，加混合液定容，搖勻，即得。

酸降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當(dāng)于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入乙腈-水(9∶1)混合溶液5 mL，再加入0.1 mol/L的鹽酸溶液2 mL，60 ℃烘箱加熱3 h，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，加乙腈-水(9∶1)混合溶液定容，搖勻，即得。

高溫降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當(dāng)于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液適量，于80 ℃水浴避光加熱10 d，取出，放冷至室溫，加混合溶液定容，搖勻，即得。

堿降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當(dāng)于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液5 mL，再加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶溶液2 mL，80 ℃水浴避光加熱10 d，取出，放冷至室溫，加入0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL，加混合溶液定容，搖勻，即得。

取上述樣品溶液注入高效液相色譜儀測(cè)定，降解實(shí)驗(yàn)色譜圖如圖7所示。

孟魯司特鈉顆粒在氧化、光照、酸性條件下穩(wěn)定性較差，在高溫與堿性條件下較穩(wěn)定(圖譜中的雜質(zhì)1、2是在空氣中氧化所致)。強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了雜質(zhì)1、2、3、6可通過(guò)降解途徑產(chǎn)生，其中雜質(zhì)1、2來(lái)源于氧化降解，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨降解強(qiáng)度的增加，降解量呈等比例增長(zhǎng)，表明雜質(zhì)1、2的生成具有相關(guān)性，結(jié)合“3.2”項(xiàng)鑒定結(jié)果，雜質(zhì)1、2的生成過(guò)程應(yīng)如圖8所示；雜質(zhì)3來(lái)源于光照降解，據(jù)EP8.0孟魯司特鈉標(biāo)準(zhǔn)可知在光照條件下孟魯司特鈉可轉(zhuǎn)化為順勢(shì)異構(gòu)體，因此雜質(zhì)3應(yīng)為孟魯司特鈉的順勢(shì)異構(gòu)體，其轉(zhuǎn)化過(guò)程為雙鍵兩側(cè)基團(tuán)由反式構(gòu)型轉(zhuǎn)化為順勢(shì)構(gòu)型(圖9)。酸性降解條件下產(chǎn)生較大量的雜質(zhì)6，根據(jù)“3.2”項(xiàng)雜質(zhì)6的鑒定結(jié)果，判定孟魯司特鈉在酸性條件下可通過(guò)分子內(nèi)羥基脫水途徑生成雜質(zhì)6(圖10)。雜質(zhì)7在降解實(shí)驗(yàn)未見(jiàn)產(chǎn)生。

Figure7 Degradation experimental chromatography

a：Oxidative degradation;b：Light degradation;c：Acid degradation;d：Thermal degradation;e：Alkaline degradation

Figure8 Formation route of impuritys1and2

Figure9 Formation route of impuritys3of montelukast sodium

Figure10 Acid degration pathway of montelukast sodium

3.3.3 制劑工藝雜質(zhì)分析 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉原料中未檢測(cè)到有關(guān)物質(zhì)7，但以該原料按照默克公司孟魯司特鈉顆粒制備工藝[8]制備所得的顆粒樣品中卻檢測(cè)到了該雜質(zhì)，說(shuō)明有關(guān)物質(zhì)7來(lái)源于顆粒制劑工藝。顆粒的制備工藝過(guò)程具體為先將甘露醇與羥丙基纖維素溶液經(jīng)流化床(氮?dú)庾隽骰瘹?制粒干燥(約60 ℃)成空白顆粒，再將空白顆粒與孟魯司特鈉水溶液經(jīng)流化床(氮?dú)庾隽骰瘹?制粒干燥(約60 ℃)成含藥顆粒，最后將含藥顆粒與硬脂酸鎂物理混合制得成品。模仿該工藝條件下物料所處環(huán)境(60 ℃，低氧)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉與羥丙基纖維素相互作用產(chǎn)生雜質(zhì)7，因孟魯司特鈉分子中具有喹啉環(huán)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，表明喹啉環(huán)結(jié)構(gòu)上的氮原子在弱氧化條件下加熱能接受氧原子而生成喹啉環(huán)氮氧化合物，該反應(yīng)在強(qiáng)氧化條件下不易發(fā)生[9]，據(jù)此并結(jié)合“3.2”項(xiàng)對(duì)雜質(zhì)7鑒定的結(jié)果，判定雜質(zhì)7較可能為孟魯司特鈉喹啉環(huán)氮氧化合物，推斷其是孟魯司特鈉在低氧高溫條件下喹啉環(huán)上的氮原子被輔料羥丙基纖維素或羥丙基纖維素中的環(huán)氧丙烷(制備工藝殘留)氧化生成。

4 結(jié) 論

孟魯司特鈉顆粒存在7個(gè)有關(guān)物質(zhì)(編號(hào)為1～7)，其中有關(guān)物質(zhì)1、2、3為降解雜質(zhì)，4、5、6為原料合成工藝雜質(zhì)，7為制劑工藝雜質(zhì)。有關(guān)物質(zhì)1、2來(lái)源于氧化降解途徑，為分子內(nèi)的硫原子氧化生成的具亞砜基團(tuán)的化合物，兩者互為立體異構(gòu)體；有關(guān)物質(zhì)3來(lái)源于光照降解途徑，為孟魯司特鈉(反式)的順式異構(gòu)體；有關(guān)物質(zhì)4、5為合成反應(yīng)時(shí)側(cè)鏈酸與孟魯司特母核上的雙鍵發(fā)生加成反應(yīng)生成的副產(chǎn)物，互為非對(duì)映異構(gòu)體；有關(guān)物質(zhì)6為合成反應(yīng)時(shí)孟魯司特鈉母核中的羥基在甲基磺酰氯的作用下脫水生成，降解實(shí)驗(yàn)表明，有關(guān)物質(zhì)6也較易通過(guò)酸性條件下羥基脫水的方式生成；有關(guān)物質(zhì)7推斷是喹啉環(huán)氮氧化物，是在高溫弱氧化條件下(約60 ℃的氮?dú)饬髦?孟魯司特鈉分子中喹啉環(huán)上的氮原子被輔料羥丙基纖維素(或其中含有成分)氧化生成，其生成量與受熱溫度與時(shí)間有關(guān)，溫度越高，受熱時(shí)間越長(zhǎng)，生成量越大。

孟魯司特鈉在光照與氧化條件下穩(wěn)定性較差，生產(chǎn)制備過(guò)程中應(yīng)注意避光、避氧。來(lái)源于顆粒制劑過(guò)程的有關(guān)物質(zhì)7未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，按照ICH分類(lèi)屬于非特定雜質(zhì)，其控制限度較低(通常不大于0.1%)，研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)7較易超過(guò)控制限度，導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不合格，因此，在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制物料的加熱溫度與受熱時(shí)間，加熱溫度越低，受熱時(shí)間越短，有關(guān)物質(zhì)7的生成量越低。