王英新，劉 玲，李樹英，蘭 頤，聶 磊

(1山東大學藥學院，濟南 250012；2山東達因海洋生物制藥股份有限公司，榮成 264300)

白三烯為引發(fā)哮喘的重要炎性介質，其在哮喘患兒氣道中存在，可增加哮喘患兒呼吸道血管通透性，導致支氣管黏膜水腫和平滑肌收縮，促進黏液栓形成，可導致支氣管阻塞加重，引發(fā)哮喘發(fā)作。孟魯司特鈉為選擇性白三烯受體拮抗劑，其與白三烯受體具有良好的親和力，用藥后可與白三烯競爭受體，對炎癥反應進行抑制，從而發(fā)揮抗炎和抗哮喘作用。孟魯司特鈉適用于成人和兒童哮喘的預防和長期治療，包括預防白天和夜間的哮喘癥狀；能夠緩解哮喘急性發(fā)作，減少激素用量，提高患兒用藥的依從性[1]；也適用于治療對阿司匹林敏感的哮喘患者及預防運動引起的支氣管收縮，具有良好的臨床效果[2-3]。

孟魯司特鈉顆粒劑為兒童哮喘預防和治療的常用藥，但目前尚未見關于孟魯司特鈉顆粒雜質譜與雜質來源詳細解析的相關文獻報道。有關物質作為藥品質量的重要屬性，關系用藥安全，同時明確雜質種類與產生途徑對制劑工藝開發(fā)與產品質量控制具有重要意義。因此，本文采用HPLC-MS/MS對市售孟魯司特鈉顆粒(順爾寧，規(guī)格4 mg)的雜質譜進行了研究，探究了其雜質譜中各雜質的來源與生成途徑，以期對該品種的制備工藝制定及產品質量控制提供參考和指導。

1 材 料

1.1 試劑與藥品

孟魯司特鈉顆粒(順爾寧?，規(guī)格4 mg；美國Merck sharp & Dohme公司，批號0000522303與0000546722)；孟魯司特鈉EP雜質對照品均購自加拿大Molcan公司：雜質對照品B(批號121107，含量97.6%)、雜質對照品C(批號121016，含量91.9%)、雜質對照品D(批號121008，含量95.3%)、雜質對照品E(批號121018，含量96.7%)、雜質對照品G(批號121014，含量90.1%)；孟魯司特鈉原料(牡丹江恒遠藥業(yè)有限公司，批號150801)。甲醇、乙腈、三氟乙酸為色譜純，水為超純水(電阻系數≥18.2 MΩ·cm，本實驗室制備)。

1.2 儀 器

高效液相質譜聯(lián)用儀(美國安捷倫公司，包含1290高效液相色譜儀、6460 Triple Quad LC/MS質譜、Mass Hunter工作站)。

2 方 法

2.1 檢測條件

色譜條件：菲羅門苯基-己基柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相A：0.15%三氟乙酸水溶液；流動相B：0.15%三氟乙酸乙腈；梯度洗脫流動相A比例變化：0～10 min 為60%，10～25 min由60%～32%，并保持32%至40 min，40.1 min變更為60%，并持續(xù)至45 min；流速1.0 mL/min；檢測波長238 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

質譜條件：電噴霧電離源，正離子化，噴霧電壓4 000 V，霧化器壓力50 psi(1 psi=6.895 kPa)，毛細管溫度350 ℃，碰撞氣為高純氮氣，碰撞電壓50 eV。

2.2 樣品制備

供試品溶液(避光操作)：稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當于孟魯司特鈉25 mg)研細，置50 mL量瓶中，加甲醇-水(9∶1)的混合溶液，振搖使溶解，0.45 μm濾膜過濾即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下供試品溶液適量，光照約5 min，生成孟魯司特鈉順式異構體，得系統(tǒng)適用性溶液。精密量取20 μL進樣測定，記錄色譜圖，順式異構體與孟魯司特鈉的分離度不小于2.5。

3 結 果

3.1 有關物質測定與雜質對照品定位

采用HPLC-VWD(紫外可見檢測器)法檢測孟魯司特鈉顆粒樣品的有關物質雜質譜，并使用孟魯司特鈉EP雜質對照品進行色譜保留時間定位，定位結果如圖1所示。

Figure1 Montelukast sodium granule related substances and impurity references positioning

A:Montelukast sodium granule impurity spectrum;B:Montelukast+ impurity references (B-G)

在孟魯司特鈉顆粒中檢測出7種有關物質(編號1～7)，其中有關物質1、3、4、5、6的保留時間分別與孟魯司特鈉EP雜質對照品C、G、E、D、B一致,可能對應為同種物質，進而采用質譜法進行進一步的鑒定確認。

3.2 雜質鑒定

采用HPLC-MS/MS法測定了孟魯司特鈉顆粒有關物質1～7及孟魯司特鈉EP雜質對照品(B、C、D、E、G)的分子離子([M+H]+)與二級碎片離子信息，測定結果見表1與圖2。

Table1 Mass spectra results of montelukast sodium related substances

Compd.t/min[M+H]+(m/z)Secondaryfragmention(m/z+)References/MMontelukast20.1586——19.9602440,472,584C/601.21210.8602440,472,584—317.8586422,440,568G/585.21419.1732311,343,456,586E/731.25519.3732311,343,453,569D/731.25625.6568—B/567.20726.9602131,157,294,438—

Figure2 Mass spectra of montelukaste sodium releated substance (A-H)

A：Impurity1;B：Impurity2;C：Impurity3product ion;D：Impurity4;E：Impurity5;F：Impurity6;G：Impurity7;H：Impurity7product ion

測定結果表明，孟魯司特鈉顆粒中的有關物質1、3、4、5、6的分子離子與二級碎片離子分別與孟魯司特鈉EP雜質對照品C(亞砜)、G(順式異構體)、E(邁克爾加成物2)、D(邁克爾加成物1)、B(甲基苯乙烯)一致,可以確定其分別對應為同一物質；雜質2與7的相對分子質量較孟魯司特大16，推測此二者為孟魯司特的氧化產物(分子內增加1個氧原子)，在孟魯司特分子中硫原子與氮原子可被氧化,產物分別為含亞砜與喹啉環(huán)氮氧化物結構的化合物。查閱文獻，歐洲藥典8.0、美國藥典40表明EP雜質C(亞砜)存在立體異構體，共存的異構體在色譜上呈現(xiàn)為相鄰的雙峰[4-5]，雜質2在相對分子質量與色譜行為上滿足以上特征，因此判定雜質2是雜質1(亞砜)的異構體。假定雜質7為喹啉環(huán)氮氧化物，在此基礎上進行二級碎片離子解析，結果表明假定與實驗結果具有較高的吻合度(圖3)，表明雜質7較可能為喹啉環(huán)氮氧化物，該雜質未見相關文獻報道。

3.3 雜質來源分析

從孟魯司特鈉(原料)的合成工藝、強制降解實驗及制劑工藝等方面進行分析，以明確孟魯司特鈉顆粒雜質1～7的來源途徑。

3.3.1 原料合成工藝雜質分析 孟魯司特鈉原料與顆粒均由默克公司研制，孟魯司特鈉合成路線[6]如圖4所示，結合“3.2”項中對雜質1～7的鑒定結果，判定雜質4、5、6應來源于合成工藝，雜質4、5為孟魯司特鈉母核分子中雙鍵發(fā)生邁克爾加成反應生成，雜質4和5的生成途徑見圖5；雜質6為甲基磺酰氯(MeSO2Cl)進攻分子中多余的羥基生成的副產物，雜質6的生成途徑見圖6。

Figure3 Structure analysis of impurity7

Figure4 Synthesis pathway of montelukast sodiums

Figure5Formation route of impurities4and5

Figure6Formation route of impurity6of montelukast sodium

3.3.2 孟魯司特鈉降解雜質分析 根據文獻調研信息[7]與“3.2”項中雜質鑒定結果，雜質1、2、3、7應為降解產物。取孟魯司特鈉顆粒，分別進行酸、堿、氧化、光照與高溫破壞，確認雜質1、2、3、7的降解途徑。

氧化降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液5 mL，加30%過氧化氫溶液2 mL，室溫避光放置10 min，加混合溶液定容，搖勻，即得。

光降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當于原料25 mg)，置50 mL無色透明量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液約30 mL，超聲1 min，置5 500 lx光照強度下照射約3.5 h，取出，加混合液定容，搖勻，即得。

酸降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入乙腈-水(9∶1)混合溶液5 mL，再加入0.1 mol/L的鹽酸溶液2 mL，60 ℃烘箱加熱3 h，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，加乙腈-水(9∶1)混合溶液定容，搖勻，即得。

高溫降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液適量，于80 ℃水浴避光加熱10 d，取出，放冷至室溫，加混合溶液定容，搖勻，即得。

堿降解樣品溶液制備：精密稱取孟魯司特鈉顆粒3 g(約相當于原料25 mg)，置50 mL棕色量瓶中，加入甲醇-水(9∶1)混合溶液5 mL，再加入0.1 mol/L的氫氧化鈉溶溶液2 mL，80 ℃水浴避光加熱10 d，取出，放冷至室溫，加入0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL，加混合溶液定容，搖勻，即得。

取上述樣品溶液注入高效液相色譜儀測定，降解實驗色譜圖如圖7所示。

孟魯司特鈉顆粒在氧化、光照、酸性條件下穩(wěn)定性較差，在高溫與堿性條件下較穩(wěn)定(圖譜中的雜質1、2是在空氣中氧化所致)。強制降解實驗確認了雜質1、2、3、6可通過降解途徑產生，其中雜質1、2來源于氧化降解，實驗中發(fā)現(xiàn)隨降解強度的增加，降解量呈等比例增長，表明雜質1、2的生成具有相關性，結合“3.2”項鑒定結果，雜質1、2的生成過程應如圖8所示；雜質3來源于光照降解，據EP8.0孟魯司特鈉標準可知在光照條件下孟魯司特鈉可轉化為順勢異構體，因此雜質3應為孟魯司特鈉的順勢異構體，其轉化過程為雙鍵兩側基團由反式構型轉化為順勢構型(圖9)。酸性降解條件下產生較大量的雜質6，根據“3.2”項雜質6的鑒定結果，判定孟魯司特鈉在酸性條件下可通過分子內羥基脫水途徑生成雜質6(圖10)。雜質7在降解實驗未見產生。

Figure7 Degradation experimental chromatography

a：Oxidative degradation;b：Light degradation;c：Acid degradation;d：Thermal degradation;e：Alkaline degradation

Figure8 Formation route of impuritys1and2

Figure9 Formation route of impuritys3of montelukast sodium

Figure10 Acid degration pathway of montelukast sodium

3.3.3 制劑工藝雜質分析 實驗中發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉原料中未檢測到有關物質7，但以該原料按照默克公司孟魯司特鈉顆粒制備工藝[8]制備所得的顆粒樣品中卻檢測到了該雜質，說明有關物質7來源于顆粒制劑工藝。顆粒的制備工藝過程具體為先將甘露醇與羥丙基纖維素溶液經流化床(氮氣做流化氣)制粒干燥(約60 ℃)成空白顆粒，再將空白顆粒與孟魯司特鈉水溶液經流化床(氮氣做流化氣)制粒干燥(約60 ℃)成含藥顆粒，最后將含藥顆粒與硬脂酸鎂物理混合制得成品。模仿該工藝條件下物料所處環(huán)境(60 ℃，低氧)進行實驗，發(fā)現(xiàn)孟魯司特鈉與羥丙基纖維素相互作用產生雜質7，因孟魯司特鈉分子中具有喹啉環(huán)，查閱相關文獻，表明喹啉環(huán)結構上的氮原子在弱氧化條件下加熱能接受氧原子而生成喹啉環(huán)氮氧化合物，該反應在強氧化條件下不易發(fā)生[9]，據此并結合“3.2”項對雜質7鑒定的結果，判定雜質7較可能為孟魯司特鈉喹啉環(huán)氮氧化合物，推斷其是孟魯司特鈉在低氧高溫條件下喹啉環(huán)上的氮原子被輔料羥丙基纖維素或羥丙基纖維素中的環(huán)氧丙烷(制備工藝殘留)氧化生成。

4 結 論

孟魯司特鈉顆粒存在7個有關物質(編號為1～7)，其中有關物質1、2、3為降解雜質，4、5、6為原料合成工藝雜質，7為制劑工藝雜質。有關物質1、2來源于氧化降解途徑，為分子內的硫原子氧化生成的具亞砜基團的化合物，兩者互為立體異構體；有關物質3來源于光照降解途徑，為孟魯司特鈉(反式)的順式異構體；有關物質4、5為合成反應時側鏈酸與孟魯司特母核上的雙鍵發(fā)生加成反應生成的副產物，互為非對映異構體；有關物質6為合成反應時孟魯司特鈉母核中的羥基在甲基磺酰氯的作用下脫水生成，降解實驗表明，有關物質6也較易通過酸性條件下羥基脫水的方式生成；有關物質7推斷是喹啉環(huán)氮氧化物，是在高溫弱氧化條件下(約60 ℃的氮氣流中)孟魯司特鈉分子中喹啉環(huán)上的氮原子被輔料羥丙基纖維素(或其中含有成分)氧化生成，其生成量與受熱溫度與時間有關，溫度越高，受熱時間越長，生成量越大。

孟魯司特鈉在光照與氧化條件下穩(wěn)定性較差，生產制備過程中應注意避光、避氧。來源于顆粒制劑過程的有關物質7未見相關文獻報道，按照ICH分類屬于非特定雜質，其控制限度較低(通常不大于0.1%)，研究發(fā)現(xiàn)有關物質7較易超過控制限度，導致產品質量不合格，因此，在生產過程中應嚴格控制物料的加熱溫度與受熱時間，加熱溫度越低，受熱時間越短，有關物質7的生成量越低。