李冰,李玉雙,*,陳琳,魏建兵,史榮久,宋雪英,周紀(jì)東,侯永俠,劉厶瑤

1.區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點實驗室,沈陽大學(xué)環(huán)境學(xué)院,沈陽 110044

2.污染生態(tài)與環(huán)境工程重點實驗室,中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所,沈陽 110016

0 前言

城市化是當(dāng)前中國社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要過程,伴隨著城市化的快速推進(jìn)[1],土地利用的格局、深度和強(qiáng)度不斷發(fā)生變化,與城市化相關(guān)的土壤環(huán)境質(zhì)量問題日益凸顯,這可能會對城市的生態(tài)安全及居民的身體健康造成影響[2]。

土壤酶與土壤質(zhì)量密切相關(guān),是土壤中具有生物活性的蛋白質(zhì)[3],參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行的諸多重要的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝過程[4-5]。大量研究表明,土壤酶活性具有綜合性、生物性和動態(tài)性特點,易受環(huán)境中物理、化學(xué)及生物因素的影響,可以反映土壤的狀態(tài)和動態(tài)變化[6]。因此,土壤酶的活性變化成為國內(nèi)外學(xué)者開展土壤環(huán)境質(zhì)量研究的重要對象[7]。土壤脲酶是土壤中最為活躍的水解酶類之一,能催化土壤中的尿素水解生成氨和CO2[8-9],其活性可以反映土壤的供氮能力,在土壤氮素循環(huán)中具有重要的作用[10]。不同來源的脲酶雖然其單體結(jié)構(gòu)有所不同,但通常都具有高度保守的氨基酸序列[11-12],使其具有十分相似的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理,催化底物專一,可以有效排除土壤反應(yīng)體系中的干擾因素[13]。有研究表明,土壤脲酶動力學(xué)參數(shù)與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān),將其活性作為土壤肥力水平的評價指標(biāo),具有一定的可靠性[14-15]。土壤微生物是土壤脲酶的重要來源,因此脲酶活性在一定程度還受到土壤微生物的影響[16]。而土壤微生物的組成和結(jié)構(gòu)對各種人為擾動具有敏感的響應(yīng)[17-18]。

城市化進(jìn)程中,伴隨著土地利用方式的改變,人為擾動強(qiáng)度增加,土壤理化性質(zhì)和土壤微生物的組成結(jié)構(gòu)也會發(fā)生相應(yīng)變化。如遲旭雯[19]等研究發(fā)現(xiàn),黑土由旱田改水田后,土壤pH 升高;陳超等[20]研究結(jié)果表明,林地有機(jī)質(zhì)含量顯著大于草地和農(nóng)田;章家恩等[21]研究表明6 種不同土地利用方式下土壤微生物數(shù)量和多樣性具有顯著差別;彭木等[22]研究結(jié)果顯示農(nóng)田土壤的細(xì)菌數(shù)量大于林地土壤;還有文獻(xiàn)報道農(nóng)田土壤脲酶活性高于草地和林地[23]。這些研究表明,土壤理化性質(zhì)和土壤微生物對土地利用方式具有敏感的響應(yīng),這必然會對土壤脲酶的活性產(chǎn)生重要影響。然而目前關(guān)于不同利用方式下土壤的理化性質(zhì),尤其是優(yōu)勢微生物菌群與土壤脲酶活性之間關(guān)系的研究還不明確。

沈陽市沈北新區(qū)是“國家可持續(xù)發(fā)展試驗區(qū)”,近年來城市化發(fā)展迅速,大量農(nóng)業(yè)用地轉(zhuǎn)變?yōu)槌墙ㄓ玫?是我國城市擴(kuò)張的典型區(qū)域。因此,本文通過分析不同利用類型土壤脲酶活性變化特征及其與土壤理化性質(zhì)、土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群之間的相關(guān)關(guān)系,探討城市擴(kuò)張區(qū)土壤脲酶活性的變化規(guī)律及其影響因素,為深入了解城市化對土壤環(huán)境質(zhì)量的影響提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤分布及樣品采集

采用均勻網(wǎng)格布點法在沈北新區(qū)全境共設(shè)置101 個采樣點(圖1),經(jīng)緯度范圍為123°16′44.45′′E— 123°42′44.27′′E,41°52′47.04′′N—42°10′4.33′′N。采樣時間為2015年9月15日—2015年10月6日,期間以晴和多云天氣為主。采樣點按土壤利用類型分為旱田、城市綠地、天然林地和水田。其中,旱田采樣點47 個,種植作物以玉米(34 個,已收割)為主、其他為蘿卜、胡蘿卜、西紅柿、黃瓜等蔬菜(成熟期)及苜蓿;城市綠地采樣點17 個,植物種類主要為楊樹、山毛桃、火炬樹、灌叢、草坪草及雜草;天然林地采樣點15 個,植被包括油松、榆樹、槭樹、蒙古櫟、楊樹;水田采樣點22 個,種植作物為水稻。采用梅花布點法,將土壤表層( 0—20 cm) 5 個位置的土壤樣品除去動植物殘體及石塊,混合均勻,帶 回實驗室,一部分于-20 ℃冷凍保存用于土壤微生物高通量測序;另一部分室溫風(fēng)干過篩,于4 ℃條件下保存供土壤酶分析使用,一周內(nèi)完成土壤酶活性測定。

圖1 沈北新區(qū)土壤采樣點分布示意圖 Figure1 Location of sampling sites in Shenyang North New Area

1.2 土壤理化性質(zhì)及脲酶活性測定

采用激光粒度儀測定土壤機(jī)械組成[24],分別測定土壤組分中0.01—2 μm 粒徑(粘粒)、2—20 μm 粒徑(粉粒)、20—200 μm 粒徑(砂粒)的含量;環(huán)刀法測定土壤容重;烘干法測定土壤含水量;玻璃電極法測定土壤pH 值(土:水=1:2.5);重鉻酸鉀-外加熱法測定土壤有機(jī)質(zhì)含量;重鉻酸鉀-硫酸消化法測定總氮;高氯酸、硫酸-鉬銻抗比色法測定總磷[25]。土壤脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定[26],每個樣品三次重復(fù)。

1.3 土壤細(xì)菌群落組成分析

采用高通量測序技術(shù)測定土壤微生物群落結(jié)構(gòu),選用Powersoil DNA Isolation Kit (MoBio,USA)試劑盒提取土壤基因組DNA,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳定性檢查以保證條帶單一,采用Nanodrop 2000 (Thermo,UAS)測定DNA 濃度及純度,然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用515F 和909R 引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V4 高變區(qū)片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、質(zhì)控后,建立Illumina 測序文庫,采用Illumina Miseq 平臺進(jìn)行Paired-end 250 bp 測序,測序工作委托中國科學(xué)院成都生物研究所完成。測序結(jié)果(.fastq)切除原始序列兩端的測序接頭后經(jīng)FLASH軟件拼接,然后用QIIME軟件根據(jù)barcode將序列分配到相應(yīng)樣品,去除低質(zhì)量序列和嵌合體之后,統(tǒng)計每個樣品中的序列數(shù),以最少的序列數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品序列的重取樣,以保證每個樣品中含有的序列數(shù)相近,從而避免因序列數(shù)不同而導(dǎo)致的樣品間差異。然后生成OTU (Operational Taxonomic Unit,采用序列相似度閾值97%)表,從每個OTU 中挑選出1 條代表序列,與細(xì)菌16S rRNA 基因序列數(shù)據(jù)庫Greengenes 進(jìn)行比對,獲得各個OTU 的物種分類信息。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Arc GIS 10.2 繪制采樣點位圖及酶活性分布圖。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用最小差數(shù)法(LSD)進(jìn)行差異顯著性分析,通過Pearson(雙側(cè))相關(guān)分析判斷土壤脲酶活性與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。利用Excel2010 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行通徑分析。采用Canoco for Windows 4.5 軟件進(jìn)行冗余分析,探究土壤細(xì)菌菌群與脲酶活性及土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 沈北新區(qū)土壤脲酶活性變化特征

圖2 沈北新區(qū)不同利用類型土壤脲酶活性空間分布特征 Figure2 Spatial distribution characteristics of urease activity in different utilization types of land in Shenyang North New Area

如圖2所示,沈北新區(qū)西北部的興隆臺錫伯族鎮(zhèn)、石佛寺朝鮮族錫伯族鄉(xiāng)、黃家錫伯族鄉(xiāng)等以水田為主的地區(qū)土壤脲酶活性較低;南部離沈陽主城區(qū)相對較近的道義街道、虎石臺街道、農(nóng)高區(qū)管委會蒲河新城管委會等以城市綠地和天然林地為主的 地區(qū)土壤脲酶活性居中;而位于沈北新區(qū)西部的尹家鄉(xiāng)、中部的財落街道、新城子街道及東部的清水臺鎮(zhèn)、馬剛鄉(xiāng)、蒲河街道等以旱田為主的地區(qū)土壤脲酶活性明顯高于其他地區(qū)?？傮w上,沈北新區(qū)土壤脲酶活性呈現(xiàn)出由東向西、由中部向南北逐漸降低的趨勢,這主要與其土地利用類型的區(qū)域分布有關(guān)。

2.2 不同利用類型土壤脲酶活性變化特征

由圖3,旱田土壤平均脲酶活性(0.52 mg·g-1)顯著高于其他三種類型土壤(P＜0.05);天然林地(0.34 mg·g-1)和城市綠地(0.32 mg·g-1)土壤脲酶平均活性次之,二者差異不明顯;水田土壤脲酶平均活性(0.19 mg·g-1)最低。梁毅等研究也發(fā)現(xiàn)不同土地利用方式影響土壤脲酶的活性,具體表現(xiàn)為:旱地＞林地＞果園＞灌叢[27],這與本文旱田土壤脲酶活性高于天然林地和以灌叢、草地為主的城市綠地的研究結(jié)果基本一致。這說明土地利用方式對土壤脲酶活性具有較大的影響。在城市化過程中,大量農(nóng)業(yè)用地轉(zhuǎn)變?yōu)槌墙ㄓ玫?其土壤脲酶活性也會發(fā)生相應(yīng)地改變,直接影響土壤的供氮能力,從而改變土壤環(huán)境質(zhì)量。就農(nóng)業(yè)用地而言,旱田改為城市綠地后土壤脲酶活力將會下降,土壤供氮能力減弱;而水田變更為城建用地后其土壤脲酶活力將會提高,土壤供氮能力增強(qiáng)。

圖3 沈北新區(qū)不同利用類型土壤脲酶活性變化特征 Figure3 Change characteristics of urease activity of different utilization types of land in Shenyang North New Area

2.3 土壤理化性質(zhì)對土壤脲酶活性的影響

由表1,土壤脲酶活性與土壤含水量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),與總磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05),而與土壤pH、容重、機(jī)械組成、有機(jī)質(zhì)、總氮相關(guān)性不顯著;說明土壤含水量和總磷是影響土壤脲酶活性的重要因素。土壤含水量與土壤機(jī)械組成呈極顯著相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),總磷與有機(jī)質(zhì)和總氮呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01),說明土壤機(jī)械組成、有機(jī)質(zhì)和總氮對土壤脲酶活性也具有一定的影響。

通徑分析結(jié)果(表2)表明,土壤含水量和總磷對土壤脲酶活性影響的直接通徑系數(shù)和綜合通徑系數(shù)均較大,說明其直接作用明顯,并最終表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綜合作用。粘粒、砂粒、有機(jī)質(zhì)和總氮對脲酶活性的直接通徑系數(shù)較大,綜合通徑系數(shù)較小,說明其直接作用明顯,但綜合作用不明顯。此外,通過分析還可發(fā)現(xiàn),含水量、粘粒、砂粒三者及總磷、總氮、有機(jī)質(zhì)三者通過彼此間對脲酶活性的間接通徑系數(shù)均較大,說明它們彼此間的相互作用對脲酶活性也有較大的影響。該分析結(jié)果與表1所示的土壤理化性質(zhì)與脲酶活性的相關(guān)關(guān)系相一致。

表1 土壤脲酶活性與不同土壤理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系 Table1 Correlation between soil urease activity and soil physical and chemical properties

表2 土壤理化性質(zhì)對脲酶活性的通徑系數(shù) Table2 Path coefficient of soil physical and chemical properties to urease activity

土壤含水量是影響脲酶活性的重要因子,土壤水分可以直接影響酶活性的高低,也可以通過影響微生物的生長和土壤養(yǎng)分的有效性間接影響土壤酶活性[28]。萬忠梅等[29]研究發(fā)現(xiàn)干濕交替和較干旱條件下土壤脲酶活性高于持續(xù)淹水狀況下的活性,并且隨含水量的增加酶活性降低;朱同彬等[28]研究表明,較高的土壤含水量會顯著抑制土壤脲酶活性,這些研究結(jié)論與本文研究結(jié)果相一致。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷通過直接和間接作用成為影響脲酶活性的重要因素。Liu SY 等[30]研究指出土壤脲酶活性與土壤有機(jī)物質(zhì)、全氮和全磷含量呈正相關(guān)。陶寶先等[31]經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn),脲酶與全磷、有機(jī)質(zhì)在P＜0.01 水平下呈顯著正相關(guān),與全氮在P＜0.05 水平下呈顯著正相關(guān)。土壤機(jī)械組成對土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)特性具有重要的影響。土壤機(jī)械組成變化有助于改變土壤緊實度、通透性能及肥力狀況,因此也會影響土壤微生物活動和土壤酶活性[32-35]。本研究結(jié)果表明土壤機(jī)械組成與土壤含水量顯著相關(guān),粘粒、粉粒含量增加,土壤持水能力增強(qiáng),含水量提高;而砂粒含量增加,土壤結(jié)構(gòu)疏松,孔隙增大,含水量下降,說明土壤機(jī)械組成可以通過土壤含水量間接影響脲酶酶活性。

2.4 土壤細(xì)菌群落組成對土壤脲酶活性的影響

土壤微生物是土壤的重要組成部分[36],大部分土壤酶是微生物新陳代謝過程中釋放的活性物質(zhì),因此酶活性在一定程度上取決于微生物的組成和結(jié)構(gòu)[37]。

通過對土壤樣品中微生物16S rRNA 基因的V4高變區(qū)進(jìn)行Illumina 測序,共檢測到70 個菌門,其中出現(xiàn)相對豐度＞10%的優(yōu)勢菌門共有9 個,分別是泉古菌門(Crenarchaeota)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、藍(lán)藻細(xì)菌(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)。

土壤中優(yōu)勢菌群豐度與理化性質(zhì)及脲酶活性的冗余分析(RDA)結(jié)果如圖4所示。從圖中夾角大小及射線長度可以看出土壤細(xì)菌菌群、理化性質(zhì)及脲酶活性間的關(guān)系。射線間夾角為銳角時表示呈正相關(guān)關(guān)系,夾角越小,相關(guān)系數(shù)越大;射線越長,所對應(yīng)的變量影響越大。擬桿菌門(a4)、酸桿菌門(a2)、厚壁菌門(a7)、泉古菌門(a1)、放線菌門(a3)與土壤脲酶活性和砂粒含量呈正相關(guān)關(guān)系,而與土壤含水量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明這些菌群的豐度隨土壤持水能力的增加而減小,與上文土壤脲酶活性隨含水量升高而降低的變化趨勢相吻合,提示這些菌群可能是土壤脲酶的重要來源。其中,放線菌門、泉古菌門、酸桿菌門射線較長,相關(guān)系數(shù)較大,說明其對土壤脲酶影響較強(qiáng)。

此外,冗余分析結(jié)果還表明酸桿菌門與土壤有機(jī)質(zhì)和總氮呈正相關(guān)關(guān)系,與土壤pH、容重、總磷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;而泉古菌門與土壤pH、容重、總磷呈正相關(guān)關(guān)系,與土壤有機(jī)質(zhì)和總氮呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,說明這兩種菌群豐度還受到土壤有機(jī)質(zhì)、總氮、pH值、容重和總磷含量不同程度的影響。有研究表明,酸桿菌門細(xì)菌屬于嗜酸菌,分布范圍較廣,在沈北新區(qū)土壤中豐度較高可能與其土壤呈弱酸性有關(guān);泉古菌在非極端土壤環(huán)境中所占的比重非常高,這也預(yù)示其在土壤生物化學(xué)循環(huán)過程中的重要作用[38]。土壤微生物除受到土壤理化性質(zhì)的影響外,還存在著復(fù)雜的相互作用,如共生和競爭關(guān)系等,因而不同利用類型土壤中微生物種群的變化規(guī)律及其對土壤酶活力的影響還需要進(jìn)一步探究。

圖4 土壤優(yōu)勢菌群豐度與理化性質(zhì)及脲酶活性的RDA 排序圖 Figure4 RDA sorting map of soil dominant bacterial abundance,soil physical and chemical properties and urease activity

3 結(jié)論

土地利用方式影響土壤脲酶活性,沈北新區(qū)不同利用類型土壤脲酶活性由高到低依次為:旱田＞天然林地＞城市綠地＞水田。

土壤含水量和總磷對土壤脲酶活性的影響除了直接效應(yīng)外,還存在較強(qiáng)的通過其它因素的間接效應(yīng),是影響土壤脲酶活性的兩個主要因素。

土壤脲酶活性與放線菌門、泉古菌門、厚壁菌門、酸桿菌門、擬桿菌門菌群豐度呈正相關(guān)關(guān)系。其中,放線菌門、泉古菌門、酸桿菌門對土壤脲酶影響較大,可能是土壤脲酶的重要來源。