唐亞男 張高峰 王明山

選擇性腦低溫現(xiàn)已被證實(shí)能夠通過減輕腦缺血-再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury, CIRI)發(fā)揮腦保護(hù)作用[1]。本課題組前期研究結(jié)果表明，CIRI時(shí)，選擇性腦低溫能夠下調(diào)線粒體分裂蛋白1(mitochondrial fission protein1, Fis1)的表達(dá)水平，穩(wěn)定線粒體超微結(jié)構(gòu)，抑制胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的釋放，減少細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[2]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類長度>200 nt，缺乏顯著開放閱讀框的RNA轉(zhuǎn)錄本，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性高表達(dá), 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和疾病發(fā)展具有重要調(diào)控作用[3-5]。大量研究表明，CIRI時(shí)腦內(nèi)多個(gè)LncRNA的表達(dá)發(fā)生改變，提示LncRNA可能在CIRI中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[6-8]。Wang等[9-10]研究結(jié)果顯示，在心肌細(xì)胞中LncRNA AK009271能通過調(diào)控Fis1的表達(dá)抑制線粒體分裂，進(jìn)而減輕細(xì)胞凋亡。此外，通過查找NCBI Gene數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)LncRNA AK009271在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)豐富表達(dá)。但LncRNA AK009271是否在CIRI時(shí)有差異性表達(dá)以及選擇性腦低溫能否通過影響LncRNA AK009271進(jìn)而抑制Fis1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路發(fā)揮腦保護(hù)作用尚未明確。本研究擬建立大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，并給予選擇性腦低溫處理，探討其對CIRI大鼠皮質(zhì)LncRNA AK009271的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，由青島大任富城畜牧有限公司提供[許可證號：SCXKL(魯)2014-007]。實(shí)驗(yàn)動物的操作及飼養(yǎng)均符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》[11]相關(guān)規(guī)定。具體動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～24°C，濕度50%～60%，12 h晝夜交替，自由攝食飲水。 按照隨機(jī)數(shù)字量表法，將所有動物隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血-再灌注組(I/R組)、低溫+缺血-再灌注組(HT組)，每組25只。

1.2 腦缺血-再灌注模型制備

采用Longa線栓法制備大鼠腦缺血-再灌注模型[12]。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，將大鼠仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺，常規(guī)頸前皮膚脫毛消毒，沿頸正中線剪開約3 cm的小口，分離并夾閉左側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，勿傷及迷走神經(jīng)。剪斷頸外動脈，將線栓沿頸外動脈至頸內(nèi)動脈插入大腦中動脈，遇到阻力時(shí)停止，進(jìn)線深度從頸總動脈分叉起18～20 mm，結(jié)扎頸外動脈近心端固定線栓，松開動脈夾?？p合切口，消毒。術(shù)中采用保溫毯維持肛溫37.0～37.2 ℃，采用激光多普勒血流儀(PeriFlux 5 000，Perimed，瑞典)監(jiān)測局部腦血流的變化。大腦中動脈血流阻斷2 h后，緩慢拔出線栓，實(shí)現(xiàn)再灌注。S組只分離血管，不做其他干預(yù)措施。所有大鼠完全蘇醒后，參照Zea Longa評分法[12]進(jìn)行5分制評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無神經(jīng)功能損傷癥狀；1分，提尾時(shí)對側(cè)前肢無力蜷縮；2分，行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。評分1～3分為造模成功。

1.3 選擇性腦低溫模型制備

參照文獻(xiàn)[13]制備選擇性腦低溫模型。HT組拔出線栓即刻將PE-50灌注管經(jīng)左側(cè)頸外動脈插入頸內(nèi)動脈5～10 mm，使用TERUMO微量泵泵注4 ℃等滲鹽水15 min(20 ml/kg)入腦, 然后恢復(fù)血液灌注。術(shù)中持續(xù)采用BAT-12微探針溫度計(jì)(Physitemp 公司，美國)監(jiān)測腦溫，電子體溫計(jì)監(jiān)測肛溫。以腦溫下降2～3 ℃而肛溫保持不變?yōu)樵炷３晒Α?/p>

1.4 神經(jīng)功能缺損評分

每組分別于再灌注6、24、48 h后隨機(jī)取5只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)如上。

1.5 定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)測定LncRNA AK009271的表達(dá)

每組分別于再灌注6、24、48 h后隨機(jī)取5只大鼠，處死后分離左側(cè)腦皮質(zhì)缺血半暗帶置于-80 ℃保存。(1)取部分組織按照總RNA提取試劑盒(Takara公司，日本)說明提取總RNA，采用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度及濃度；(2)根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，日本)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并保存于-20 ℃；(3)將cDNA按照qRT-PCR上機(jī)試劑盒(Takara公司，日本)配置PCR反應(yīng)體系，并置于ABI 7300熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(CA公司，美國)進(jìn)行PCR。LncRNA AK009271上游引物：5′-GCAAAGGGTATGAAATGAATGTCTC-3′，下游引物：5′-CAACATCCCAACTCCACAACC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3′；下游引物：5′-TGGACTCCACGACGTACTC-3′。采用2-ΔΔCt[14]計(jì)算LncRNA AK009271的相對表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。

1.6 Western Blot測定Fis1的表達(dá)

每組隨機(jī)取5個(gè)再灌注24 h的腦皮質(zhì)缺血半暗帶樣本，加入細(xì)胞裂解液和磷酸酶抑制劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)進(jìn)行低溫勻漿，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法測定蛋白濃度。配制分別含10%和5%丙烯酰胺的分離膠和濃縮膠，加樣(蛋白50 μg)進(jìn)行電泳濃縮、分離，半干法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜完成后1×洗膜緩沖液(Tris buffered saline Tween, TBST) 沖洗，3%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000，Abcam公司，英國)，4 ℃孵育過夜。次日復(fù)溫 1 h，1×TBST沖洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000，北京中杉金橋科技公司)，室溫孵育3 h，1×TBST 沖洗，滴加化學(xué)發(fā)光劑，顯影，保存圖片，采用Image J軟件(NIH公司，美國)進(jìn)行分析，以Fis1條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值反映Fis1表達(dá)水平。

1.7 電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)

每組分別于再灌注24 h后隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟依次灌注0.9%等滲鹽水和2%的戊二醛后斷頭取腦，分離缺血半暗帶，用眼科剪將其剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，放入已預(yù)冷的25%戊二醛中固定，并置于4 ℃冰箱。檢測時(shí)按常規(guī)電鏡樣本制備程序，制備50 μm厚的超薄切片，晾干、枸櫞酸鉛電子染色；透射電鏡(Hitachi公司，日本)下觀察，拍照。

1.8 細(xì)胞凋亡率測定

每組分別于再灌注24 h后隨機(jī)取5只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟依次灌注0.9%等滲鹽水和4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液，分離大腦皮質(zhì)缺血半暗帶后常規(guī)固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)5 μm厚冠狀切片，烤片后4 ℃儲存?zhèn)溆?。采用原位末端?biāo)記法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)染色，具體步驟按照TUNEL試劑盒(Merck公司，德國)說明書進(jìn)行。常規(guī)脫蠟水化，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯色，400倍光鏡下，每個(gè)腦組織隨機(jī)選取3個(gè)腦片，每個(gè)腦片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)視野，人工計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算平均值即為細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞核中TUNEL陽性細(xì)胞表現(xiàn)為棕黃色顆粒，即凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)÷總細(xì)胞計(jì)數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 溫度

與I/R組比較，HT組4 ℃等滲鹽水灌注15 min時(shí)腦溫下降(P<0.05)，肛溫差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠缺血-再灌注(血液/4 ℃等滲鹽水)15 min時(shí)溫度監(jiān)測結(jié)果比較

注：I/R組為缺血-再灌注組，HT組為低溫+缺血-再灌注組

2.2 神經(jīng)功能缺損評分

S組神經(jīng)功能缺損評分為0分；與S組比較，I/R組和HT組再灌注各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分升高(均P<0.05)；與I/R組比較，HT組再灌注各時(shí)點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評分降低(均P<0.05)。見圖1。

2.3 各組LncRNA AK009271表達(dá)的比較

與S組比較，I/R組再灌注各時(shí)點(diǎn)LncRNA AK009271表達(dá)降低(均P<0.05)；隨著再灌注時(shí)間的增加，LncRNA AK009271的表達(dá)發(fā)生改變，且再灌注24 h LncRNA AK009271的表達(dá)最低(P<0.05)，因此確立再灌注24 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)；與S組比較，HT組再灌注各時(shí)點(diǎn)LncRNA AK009271的表達(dá)降低(均P<0.05)；與I/R組比較，HT組再灌注各時(shí)點(diǎn)LncRNA AK009271的表達(dá)增加(均P<0.05)。見圖2。

2.4 各組Fis1表達(dá)的比較

與S組比較，I/R組和HT組再灌注24 h Fis1的表達(dá)增加(均P<0.05)；與I/R組比較，HT組再灌注24 h Fis1表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3,4。

2.5 各組線粒體超微結(jié)構(gòu)的比較

電鏡下觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)(箭頭所示)，顯示再灌注24 h后，S組線粒體形態(tài)正常，多呈圓狀或桿狀，雙層膜結(jié)構(gòu)完整，未出現(xiàn)腫脹和空泡變性；I/R組可見大量線粒體腫脹變圓，部分可見嵴斷裂和空泡化現(xiàn)象；HT組線粒體形態(tài)破壞程度較I/R組輕，線粒體分布較均勻，嵴尚清晰且排列尚可，僅可見少量線粒體腫脹和空泡變性。見圖5。

2.6 各組細(xì)胞凋亡率的比較

TUNEL染色后，S組大鼠細(xì)胞核幾乎呈藍(lán)色，極少呈棕黃色或棕褐色，即凋亡細(xì)胞(箭頭所示)；I/R組和HT組大鼠再灌注24 h后，黃染細(xì)胞核即凋亡細(xì)胞明顯增多；在經(jīng)過選擇性腦低溫處理后，與I/R組比較，HT組黃染細(xì)胞核減少。細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果顯示，與S組比較，I/R組和HT組再灌注24 h細(xì)胞凋亡率明顯增加(均P<0.05)；與I/R組比較，HT組再灌注24 h后細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見圖6，7。

3 討論

近年來研究結(jié)果表明，LncRNA的失調(diào)與人類疾病密切相關(guān)，目前LncRNA的研究覆蓋了神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病、腫瘤等疾病的病理生理過程[15-16]。在缺血性卒中方面，Dharap等[17]研究發(fā)現(xiàn)，局部腦缺血后誘導(dǎo)腦內(nèi)一系列LncRNA表達(dá)模式的改變，表明LncRNA可能在缺血性卒中的病理生理過程中有著重要作用。

細(xì)胞凋亡是CIRI后神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要途經(jīng)[18-20]。Fis1是一種錨定在線粒體外膜上的相對分子量17 000的適配蛋白，其通過募集胞漿中的動力而相關(guān)蛋白1至線粒體外膜介導(dǎo)線粒體的分裂[21]，線粒體過度分裂會導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)改變，引起線粒體膜通透性增加和促凋亡蛋白-細(xì)胞色素C釋放，激活凋亡級聯(lián)反應(yīng)，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加重神經(jīng)功能損傷[22]。Fis1過表達(dá)時(shí)線粒體分裂和細(xì)胞凋亡增加；反之，F(xiàn)is1缺失時(shí)線粒體分裂和細(xì)胞凋亡受到抑制[23-24]。Wang等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA AK009271可以負(fù)向調(diào)控Fis1的表達(dá)，進(jìn)而抑制Fis1介導(dǎo)的線粒體分裂和細(xì)胞凋亡通路。但缺血性卒中時(shí)，LncRNA AK009271的表達(dá)模式是否發(fā)生變化尚未有明確研究。因此，本研究采用Longa線栓法栓塞大腦中動脈制備大鼠腦缺血-再灌注模型，該模型可以較好地模擬缺血性卒中的病理生理變化。結(jié)果表明，CIRI時(shí)，大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)LncRNA AK009271的表達(dá)明顯下調(diào)，且在再灌注24 h差異性表達(dá)最明顯。

低溫由于其具有腦保護(hù)作用而得到廣泛關(guān)注。選擇性腦低溫是一種保持核心溫度不變，選擇性降低腦組織溫度的低溫方法，其與全身性低溫相比，降溫速度快、不良反應(yīng)少，更適合用于缺血性卒中后的腦保護(hù)[1]。本研究參照文獻(xiàn)[13]于再灌注即刻行頸內(nèi)動脈灌注4 ℃等滲鹽水15 min(20 ml/kg)，低溫液體經(jīng)頸內(nèi)動脈進(jìn)入大腦中動脈后通過Willis環(huán)迅速實(shí)現(xiàn)全腦降溫，并在手術(shù)過程中監(jiān)測腦溫和肛溫。結(jié)果表明，選擇性腦低溫模型成功構(gòu)建，且在經(jīng)過選擇性腦低溫處理后，大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低，提示選擇性腦低溫具有腦保護(hù)作用。此外，本課題組前期研究結(jié)果表明[2]，選擇性腦低溫能夠通過下調(diào)Fis1的表達(dá)，抑制線粒體分裂和凋亡，從而減輕CIRI發(fā)揮腦保護(hù)作用。但選擇性腦低溫是否通過調(diào)節(jié)LncRNA AK009271的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控Fis1的水平尚未有明確研究。

本研究采用qRT-PCR測定了大鼠皮質(zhì)腦缺血半暗帶區(qū)LncRNA AK009271的表達(dá)，結(jié)果表明，CIRI時(shí)LncRNA AK009271的表達(dá)明顯下調(diào)，且在再灌注24 h最明顯；而在經(jīng)過選擇性腦低溫處理后，LncRNA AK009271的表達(dá)明顯上調(diào)，提示LncRNA AK009271可能參與了CIRI的病理生理過程，且低溫腦保護(hù)作用可能與其相關(guān)。此外，為了探討LncRNA AK009271-Fis1-細(xì)胞凋亡通路是否參與了低溫腦保護(hù)作用，本研究選取CIRI時(shí)LncRNA AK009271差異性表達(dá)最顯著的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)一步測定了大鼠皮質(zhì)腦缺血半暗帶Fis1的表達(dá)及細(xì)胞凋亡，并在電鏡下觀察了線粒體超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，LncRNA AK009271在I/R組的表達(dá)明顯低于S組，而Fis1的表達(dá)及細(xì)胞凋亡明顯增加，線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重；與此相反，LncRNA AK009271在HT組的表達(dá)明顯高于I/R組，而Fis1的表達(dá)及細(xì)胞凋亡明顯下降，線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷較輕。這提示選擇性腦低溫可能通過調(diào)節(jié)LncRNA AK009271的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控Fis1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述，選擇性腦低溫可能通過上調(diào)LncRNA AK009271的表達(dá)，進(jìn)而抑制Fis1的表達(dá)，穩(wěn)定線粒體超微結(jié)構(gòu)，減輕細(xì)胞凋亡，從而改善CIRI大鼠的神經(jīng)功能。但選擇性腦低溫調(diào)控LncRNA AK009271通路的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，以期待未來能夠發(fā)現(xiàn)治療缺血性卒中的新靶點(diǎn)。