孫洲 向栩瑩 晏桂林 陸觀鳳 楊燕澤 鐘玉馨 張磊

腦梗死后促進腦血管再通，盡快開放有效循環(huán)，及時恢復缺血半暗帶血流量仍是直接有效的治療措施[1]。在生理情況下，緩激肽受體B2(bradykinin 2 receptor，B2R)廣泛表達于全身各處組織，而緩激肽受體B1(bradykinin 1 receptor，B1R)在損傷、感染等應激情況下表達上調(diào)[2]。尤瑞克林的有效成分是組織激肽酶原1，后者為體內(nèi)重要的炎性調(diào)節(jié)系統(tǒng)即激肽酶原-激肽釋放系統(tǒng)的組成部分，尤瑞克林能將低分子量的激肽原裂解，裂解產(chǎn)物可靶向作用于2種G蛋白偶聯(lián)受體，分別為B1R和B2R，從而產(chǎn)生血管擴張、平滑肌收縮等生物學效應[3]。近年來，關于尤瑞克林應用于急性腦梗死獲益的研究結(jié)果在不斷報道[4]，已知的是尤瑞克林的神經(jīng)保護作用與影響血液流變學[5]和改善內(nèi)皮功能[6]有關，而關于尤瑞克林影響B(tài)1R和B2R表達的研究較少[7]。本實驗通過建立大鼠缺血-再灌注模型，觀察急性腦梗死后B1R和B2R的變化，以及不同劑量的尤瑞克林對其表達的影響，并通過觀察不同組腦梗死邊緣區(qū)域微血管密度相較B1R、B2R表達的趨勢，尋找其促進血管新生作用的證據(jù)，進一步明確尤瑞克林改善神經(jīng)功能的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級8周齡雄性SD大鼠(體質(zhì)量為230～270 g)，全部采購于華中科技大學同濟醫(yī)學院實驗動物供應中心[合格證號：SYXK (鄂) 2015-0053]。實驗大鼠全程由專員飼養(yǎng)，保持大鼠正常干燥環(huán)境，室溫(25.0±2.0) ℃，自由飲食、飲水，自然晝夜節(jié)律。所有大鼠手術操作選擇于10%水合氯醛腹腔麻醉下進行。實驗具體實施方案獲得華中科技大學同濟醫(yī)學院動物保護與使用委員會的審核批準并通過。

1.2 試劑及儀器

注射用尤瑞克林干粉針劑(凱力康，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司) ；磷酸鹽緩沖液[谷歌生物，中國)、瓊脂糖(Invitrogen公司，美國]、總RNA抽提試劑(Invitrogen公司，美國)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司，日本)、DNA Marker(TAKARA公司，日本)、無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，中國)、EDTA抗原修復液(谷歌生物，中國)、二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，中國)、抗熒光淬滅劑(碧云天，中國)、氯仿(谷歌生物，中國)、牛血清白蛋白(Sigma公司，德國)、兔抗大鼠血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF，三鷹生物技術公司,中國)、熒光二抗[谷歌生物(488-Alex山羊抗兔)，中國]。脫水機(武漢俊杰電子有限公司)、病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)、微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司，中國)、脫色搖床(北京市六一儀器廠)、免疫組織化學筆(Gene Tech公司，中國)、熒光顯微鏡(日本尼康)、電子天平稱重計(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、紫外分光光度計(NUAIRE公司，美國)、高速離心機(Sigma公司，德國)、溫度梯度PCR儀(德國Eppendorff)、光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occulation，MCAO)缺血-再灌注模型制作

大鼠右側(cè)MCAO缺血-再灌注模型采用改良后Zea Longa線栓方法[8]，大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，備皮、消毒，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈，游離頸外動脈至分叉處，在頸外動脈下方穿入3根手術絲線，在距離頸動脈分叉約5 mm處近心端和遠心端分別結(jié)扎頸外動脈，用眼科剪在頸外動脈近心端剪一個“V”形口，將標記并制備好的栓線插入頸外動脈，用止血鉗輕輕牽拉手術絲線使頸外與頸內(nèi)動脈成180°角，沿著頸外動脈近心端推送線栓入顱內(nèi)至大腦中動脈，于缺血2 h行神經(jīng)功能缺損評分，采用Longa評分法剔除評分為0、4分等不滿足實驗條件的動物模型，對于有嚴重呼吸困難，提前死亡或到達研究終點處死時腦出血或畸形的實驗大鼠均嚴格按照實驗標準剔除[9]。檢測模型成功后拔出線栓，形成缺血-再灌注。假手術組僅分離頸總動脈，不插入線栓，保證其他條件與模型組相同。造模成功的25只SD大鼠按隨機抽樣法分為5組，每組5只，分別為假手術組、I/R模型組(I/R+等滲鹽水組)、尤瑞克林低劑量治療組(I/R+LDP組，3.50×10-3PNAU/kg)、尤瑞克林中等劑量治療組(I/R+MDP組，8.75×10-3PNAU/kg)、尤瑞克林高劑量治療組(I/R+HDP組，17.50×10-3PNAU/kg)，術后30 min首次給予尤瑞克林，每天定時注射1次，均為尾靜脈注射，連續(xù)注射7 d后取材。

1.4 實時定量RT-PCR

摘取缺血側(cè)梗死交界區(qū)皮質(zhì)腦組織，去除軟腦膜，稱取腦組織重量，加入1 ml總RNA抽提試劑，進行充分勻漿，提取RNA，后進行PCR擴增，引物序列及引物長度如下。(鼠)B1R引物序列：B1R F為 5′-CCACATTCCTTCTACGCTCTG-3′；B1R R為:5′-CGTTCAACTCCACCATCCTT-3′。(鼠)B2R引物序列:B2R F:5′-CTGTCGTGGAAGTGGCTATGT-3′；B2R R為:5′-AAAGGTCCCGTTATGAGCAG-3′。以β-actin為內(nèi)參物，引物序列:β-actin F為:5′- CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′；β-actin R:5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。

提取總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應后，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增反應，上下游引物各0.5 μl，dNTP 2 μl，Taq酶0.25 μl，酶緩沖液2.5 μl，ddH2O加水至25 μl，分別依次在94 ℃條件下預變性4 min，94 ℃條件下30 s，56 ℃條件下退火30 s，72 ℃條件下延伸25 s；共經(jīng)過30個循環(huán)，然后在72 ℃條件下總延伸4 min，最后于4 ℃反應條件下反應4 min，擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，通過Image J軟件分析電泳條帶相對灰度值得出實驗數(shù)據(jù)，使用GraphPad分析軟件進行繪圖。

1.5 vWF免疫熒光法檢測微血管密度(microvessel density，MVD)

通過vWF免疫熒光測定缺血-再灌注大鼠7 d時腦梗死交界區(qū)MVD。各組切片脫蠟、脫水后進行抗原修復，用一抗vWF覆蓋腦組織切片，切片甩干以后在畫好的圈內(nèi)均勻滴入與vWF一抗對應種屬的熒光二抗(488-Alex山羊抗兔)覆蓋，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)液進行細胞核復染，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下即時采集免疫熒光組織切片鏡檢影像。微血管計數(shù)借鑒Weidner法[10]。計數(shù)微血管時，無論血管管腔完整與否，血管直徑≤8個紅細胞直徑(50～60 μm)的熒光綠染血管，或單個與周圍血管不相鄰的熒光標記的內(nèi)皮細胞或細胞群都認為是一個可計數(shù)的微血管，有較厚平滑肌壁的血管除外。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測缺血-再灌注7 d腦梗死交界區(qū)B1R和B2R的mRNA表達

缺血-再灌注后7 d，各組B1R、B2R的mRNA相對表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。I/R+等滲鹽水組與I/R+LDP組與比較，以及I/R+HDP組與I/R+LDP組、I/R+MDP組比較，B1R的mRNA表達差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。假手術組與I/R+等滲鹽水組比較，I/R+LDP組與I/R+等滲鹽水組比較，I/R+LDP組、I/R+MDP組與I/R+HDP組比較，B2R的mRNA表達差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 缺血-再灌注后7 d假手術組與MCAO模型大鼠腦組織B1R及B2R的mRNA表達

注：MCAO為大腦中動脈栓塞，I/R為缺血-再灌注，LDP、 MDP、HDP分別為低劑量，中等劑量、高劑量尤瑞克林；假手術組僅給予分離頸總動脈，不插入線栓；I/R+等滲鹽水組為缺血-再灌注模型組，另3組分別于造模成功后連續(xù)7 d尾靜脈注射低劑量、中等劑量、高劑量尤瑞克林；與I/R+等滲鹽水組比較，aP<0.05； 與I/R+LDP組比較，bP<0.05；與I/R+MDP組比較，cP<0.05;與假手術組比較，dP<0.05

2.2 缺血-再灌注后梗死交界區(qū)MVD

缺血-再灌注7 d，I/R+等滲鹽水組與假手術組比較，缺血-再灌注后梗死交界區(qū)MVD升高，差異有

統(tǒng)計學意義(P<0.01)。I/R+LDP組與I/R+等滲鹽水組比較，缺血-再灌注后梗死交界區(qū)MVD升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。I/R+MDP組與I/R+LDP組比較，缺血-再灌注后梗死交界區(qū)MVD差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)。I/R+HDP組與I/R+LDP組、I/R+MDP組比較，缺血-再灌注后梗死交界區(qū)MVD均升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01，圖1，表2)。

表2 缺血-再灌注后7 d假手術組與MCAO模型大鼠腦梗死交界區(qū)微血管計數(shù)比較個/mm2)

注：MCAO為大腦中動脈栓塞，I/R為缺血-再灌注，LDP、 MDP、HDP分別為低劑量，中等劑量、高劑量尤瑞克林；假手術組僅給予分離頸總動脈，不插入線栓；I/R+等滲鹽水組為缺血-再灌注模型組，另3組分別于造模成功后連續(xù)7 d尾靜脈注射低劑量、中等劑量、高劑量尤瑞克林；與假手術組比較，aP<0.01；與I/R+等滲鹽水組比較，bP<0.01；與I/R+LDP組比較，cP<0.01；與I/R+MDP組比較，dP<0.01

3 討論

尤瑞克林的有效成分是人尿激肽原酶，其改善神經(jīng)功能的機制為減輕炎性反應[10]、促進神經(jīng)干細胞增殖分化[11]、抑制神經(jīng)細胞凋亡[12]。近來研究表明，開放循環(huán)、促進血管新生可能是尤瑞克林改善其他病理變化的中心環(huán)節(jié)[13]。本實驗結(jié)果表明，大鼠腦缺血-再灌注7 d時B1R及B2R均有明顯表達，與已有文獻報道結(jié)果一致[14]。根據(jù)生理情況下B1R少有表達，而病理情況下B1R可誘導產(chǎn)生。本研究缺血-再灌注7 d時假手術組B1R少量表達，考慮主要與假手術操作所致應激反應相關；尤瑞克林各劑量組較I/R+等滲鹽水組對B1R、B2R均有明顯的上調(diào)作用，且高劑量的尤瑞克林作用效果更為明顯。以往鮮有對不同劑量尤瑞克林與緩激肽受體表達關系的文獻報道，但有研究結(jié)果支持不同劑量的尤瑞克林對大鼠腦缺血后神經(jīng)保護作用不同[15-16]。

正常情況下B2R在各組織均有表達，B1R則在缺血性疾病、炎性反應等情況下誘導產(chǎn)生。在心臟和血管研究中發(fā)現(xiàn)，在B2R缺失的情況下，未發(fā)現(xiàn)B1R代償性增多，因此認為B2R在血管發(fā)生中具有重要的作用[17-18]。本研究應用尤瑞克林對缺血-再灌注大鼠進行體內(nèi)實驗觀察其影響，結(jié)果表明，不同劑量組尤瑞克林均能上調(diào)B1R、B2R mRNA的相對表達水平，但高劑量的尤瑞克林效果更為明顯，B1R、B2R mRNA隨藥物劑量上升幅度相似，推測尤瑞克林對2種受體的上調(diào)具有一致性。缺血-再灌注7 d，梗死交界區(qū)MVD較假手術組自發(fā)增高，考慮為腦梗死代償性血管新生，隨尤瑞克林劑量增高梗死交界部位MVD亦升高。比較不同劑量尤瑞克林上調(diào)B1R和B2R表達、增加區(qū)域MVD的作用效果，均為高劑量尤瑞克林組更為顯著，推測尤瑞克林用藥可能在早期從一定程度上在腦缺血后增補了機體自身B2R的表達，從而達到促血管新生的效果。這為進一步的機制研究提供了有價值的方向。但本實驗仍有不足之處，B1R、B2R可能在不同時期對開放側(cè)支循環(huán)和促進血管新生起到不同的作用，隨著研究的不斷深入，尤瑞克林影響緩激肽受體表達的確切機制會更加清晰。

綜上所述，各劑量尤瑞克林均上調(diào)缺血-再灌注后大鼠B1R、B2R表達，發(fā)揮促進血管新生的作用，且高劑量的尤瑞克林對血管新生作用效果更為明顯。