商婷 趙靈娟 李佩 曾祥英 于志強(qiáng)

摘?要?通過檢測人體尿液中多種羥基多環(huán)芳烴（OH-PAHs）的濃度可全面評估多環(huán)芳烴（PAHs）在人體的負(fù)荷水平。本研究建立并優(yōu)化了一種基于固相支撐液液萃取（SLE）的前處理技術(shù)，在此基礎(chǔ)上，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）測定人體尿液中的10種OH-PAHs。尿樣采用硅藻土SLE柱進(jìn)行富集凈化，二氯甲烷-正己烷（3∶7， V/V）混合溶液作為目標(biāo)化合物的洗脫液。前處理優(yōu)化結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有較好的回收率，同時可有效降低生物基質(zhì)的干擾。本方法在3個加標(biāo)濃度水平（10、50和100 μg/L）下的回收率為88.5%～120.9%，重復(fù)性精密度范圍為1.6%～8.1%。檢出限與定量限分別在0.06～0.3 μg/L和0.2～1.0 μg/L之間。本方法成功用于廣東省小學(xué)生尿液中OH-PAHs的測定， 結(jié)果表明，2-OHN是最主要的檢出化合物，最高濃度達(dá)到4.83 μg/L。

關(guān)鍵詞?單羥基多環(huán)芳烴; 尿液; 固相支撐液液萃取; 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

1?引 言

多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中具有兩個或兩個以上苯環(huán)的一類碳?xì)浠衔铮渲饕獊碓词敲?、石油、木材等不完全燃燒或熱裂解產(chǎn)物[1]。PAHs可通過呼吸道、皮膚和消化道等多種暴露途徑進(jìn)入人體，經(jīng)體內(nèi)代謝形成羥基多環(huán)芳烴（OH-PAHs），并以葡萄糖醛酸、硫磺酸結(jié)合物的形式主要通過尿液排泄[2]。由于它們具有潛在的“三致”（致癌、致畸、致突變）效應(yīng)以及在全球分布的廣泛性[3]，PAH對人體健康的潛在危害成為世界各國廣泛關(guān)注的環(huán)境污染問題，人體內(nèi)暴露水平的評估是開展PAHs健康風(fēng)險評價的重要基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

已有研究顯示，尿中PAHs代謝物的測定通常與PAHs暴露密切相關(guān)[4]。由2～4個苯環(huán)組成的分子量較小的OH-PAHs，主要通過尿液排泄，而分子量較高的OH-PAHs（苯環(huán)數(shù)量>4）主要通過糞便排泄[5，6]。由于PAHs的暴露途徑復(fù)雜多變，各種暴露途徑對人體內(nèi)暴露的貢獻(xiàn)難以準(zhǔn)確評估，因此，人體尿液中OH-PAH的測定成為評價PAH內(nèi)暴露水平的重要生物標(biāo)志物。目前，固相萃?。⊿PE）[6～11]與液液萃?。↙LE）[12～17]是應(yīng)用最廣泛的樣品前處理方法。SPE具有重現(xiàn)性穩(wěn)定以及裝置價格合理、易于獲取等特點，但樣品前處理使用相應(yīng)的萃取柱時需活化、平衡和清洗等步驟，耗時耗力。LLE常用溶劑有戊烷、二氯甲烷和正己烷等，選擇性高，分離效果較好，但操作復(fù)雜，溶劑使用量大，且易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象導(dǎo)致重復(fù)性較差，且上述前處理技術(shù)存在目標(biāo)化合物回收率不穩(wěn)定、生物基質(zhì)干擾嚴(yán)重等技術(shù)難點，無法滿足流行病學(xué)大樣本量研究的需求，因此，開發(fā)快速、高效的前處理技術(shù)成為OH-PAHs內(nèi)暴露研究的重要內(nèi)容。

SLE柱采用了特殊工藝處理過的硅藻土，擁有最大的比表面積和最低的表面活性，能提供一個理想的液液分配的支撐表面，可代替大部分傳統(tǒng)的LLE方法[18]。在傳統(tǒng)LLE方法基礎(chǔ)上，SLE方法利用分析物在兩相中不同的溶解度和分配比，采用經(jīng)過高度改良的具有高比表面積的多孔硅藻土作為吸附劑，結(jié)合其吸水性強(qiáng)、化學(xué)惰性等特點，快速附樣品基質(zhì)中的水分，使目標(biāo)物與水分分離，具有不易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象、基質(zhì)效應(yīng)降低和需要樣品量少等優(yōu)點[19]。樣品前處理時，使用相應(yīng)的萃取柱，僅需上樣和洗脫兩步，即可從水相中萃取目標(biāo)化合物。當(dāng)加入水性生物樣品時，樣品在填料的表面擴(kuò)散并被吸收，從而形成萃取界面，相當(dāng)于LLE的界面，當(dāng)與水不相溶的有機(jī)溶劑加入后，目標(biāo)分析物被有機(jī)溶劑溶解并收集下來。相較于LLE、SPE等傳統(tǒng)尿液前處理方法，SLE可有效提高樣品的提取能力和效率，已廣泛應(yīng)用于人體尿液和血液樣品的前處理[20～28]，如Meunier等[28]用甲基叔丁基醚提取血漿樣品的醛固酮，方法方便簡單。Liu等[23]利用正己烷萃取人體血液和尿液中的多環(huán)麝香，無需調(diào)節(jié)pH值和鹽度，樣品制備時間顯著縮短（～15 min）。上述研究結(jié)果表明，利用SLE方法可以對生物體液中的污染物進(jìn)行高通量分析。

本研究選擇人尿液中的1-羥基萘（1-OHN）、2-羥基萘（2-OHN）、2-羥基芴（2-OHF）、3-羥基芴（3-OHF）、1-羥基菲（1-OHPhe）、2-羥基菲（2-OHPhe）、3-羥基菲（3-OHPhe）、4-羥基菲（4-OHPhe）、9-羥基菲（9-OHPhe）和1-羥基芘（1-OHP）共10種OH-PAHs為目標(biāo)物，通過SLE洗脫溶劑的篩選和優(yōu)化，確定前處理富集凈化方法，然后使用LC-MS/MS 技術(shù)對其進(jìn)行定性和定量分析，為尿液中常見的PAHs代謝產(chǎn)物檢測提供了科學(xué)依據(jù)。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

1100型液相色譜儀（LC，美國Agilent公司）-API4000三重四極桿質(zhì)譜儀（MS/MS，美國AB SCIEX公司）; HeraeusTM LabofugeTM200臺式離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）; 氮吹儀（美國Pierce公司）; 12孔固相萃取裝置（美國Supeclo公司）; Milli-Q Unique-R10超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）; 0.2 μm聚四氟乙烯膜濾頭（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）; 5-mL SLE固相支撐液液萃取小柱（瑞典Biotage公司）。

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正戊烷、甲苯和甲醇等有機(jī)溶劑均為色譜級（99.9%，德國Merck公司）; 醋酸鈉和冰醋酸 （99.97%，美國Tedia公司）; HCl（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%，德國 Sigma-Aldrich 公司）; β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶（美國Sigma公司，含122400單位/mL β-葡糖苷酸酯酶和3610 單位/mL芳基硫酸酯酶）; 實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

10種OH-PAHs標(biāo)樣（1-OHN、2-OHN、2-OHF、3-OHF、1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、4-OHPhe、9-OHPhe和1-OHP）均購于美國Supelco公司; 同位素標(biāo)記的標(biāo)樣（D8-1-OHN和D9-1-OHP）來自美國劍橋同位素實驗室。

2.2?尿液樣品采集

尿液樣本的采集對象為廣州市某小學(xué)四年級學(xué)生，所有志愿者均自愿參加，并在家長的引導(dǎo)下簽署同意書，本研究隨機(jī)選取了20例尿液樣本進(jìn)行檢測，對方法應(yīng)用進(jìn)行驗證。尿液樣本采集后保存于預(yù)先處理過的聚乙烯塑料瓶中，于80℃放置備用。

隨機(jī)采取實驗室志愿者（22～28歲）尿液10例，每例取10 mL進(jìn)行混合，形成的混合尿液基質(zhì)用于方法優(yōu)化。

2.3?樣品前處理

樣品置于室溫下解凍后，3000 r/min離心10 min，取上清液，準(zhǔn)確量取2 mL，加入10 ng回收率指示物（D8-1-OHN和D9-1-OHP），加1 mol/L HCl溶液與醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)樣品至pH 5.0，加β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶20 μL，充分混勻，置于恒溫振蕩器中于37 ℃下避光酶解16 h。將酶解后的樣品加入固相支撐液液萃取小柱中，施加2～10 s的真空或正壓，等待5 min，使樣品分散并充分吸附于填料表面。以5 mL二氯甲烷-正己烷（3∶7， V/V）混合溶液作為洗脫溶劑，連續(xù)洗脫3次，合并收集到的洗脫液進(jìn)行氮吹，以甲醇定容至400 μL。用0.2 μm的尼龍膜過濾后，于20℃保存， 備用。

2.4?儀器分析

采用Eclipse-C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 美國Agilent公司）為色譜分析柱， 進(jìn)樣量為10 μL， 以水（A）和甲醇（B）為流動相， 流速為0.6 mL/min， 梯度洗脫程序： 0～5 min， 60% B; 5～14 min， 60%～78% B; 14～21 min， 78%～85% B; 21～30 min， 85%～100% B; 30～35 min， 100% B; 35～39 min， 100%～60% B; 39～45 min， 60% B。質(zhì)譜檢測采用電噴霧離子源（ESI）， 負(fù)離子模式， 電壓4500 V， 離子源溫度450℃， 霧化氣壓力50 psi， 輔助氣壓力60 psi， 窗簾氣壓力30 psi; 采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。各目標(biāo)化合物保留時間和定性定量離子對見表1。

3?結(jié)果與討論

3.1?洗脫溶劑的優(yōu)化

用于SLE柱的洗脫溶劑需與水不混溶，同時對OH-PAH具有良好的溶解性，因此溶劑的選擇主要取決于目標(biāo)物的溶解度和極性等特性。對于非極性化合物，非極性溶劑（如庚烷、戊烷、己烷）較為理想，而弱極性化合物，需選擇有一定極性的有機(jī)溶劑，如甲基叔丁基醚、二氯甲烷或乙酸乙酯。目標(biāo)OH-PAHs的pKa值在8.0～9.2之間，具有弱極性?；诖?，選取正己烷（Hex）、甲苯（MB）、戊烷（Pen）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtAC）、甲基叔丁基醚（MTBE）作為洗脫溶劑進(jìn)行優(yōu)化，通過10種OH-PAHs的回收率進(jìn)行評價。

不同溶劑體系對10種OH-PAHs回收率的影響如圖1所示，每種溶劑對OH-PAHs都有一定洗脫效率，其中DCM對各目標(biāo)化合物的回收率均較理想。但由于DCM極性強(qiáng)，洗脫能力隨之增強(qiáng)，因此洗脫下來的化合物相對較多，在LC-MS/MS進(jìn)樣時發(fā)現(xiàn)具有較多的非目標(biāo)化合物被檢測到，因此本研究中進(jìn)一步考慮采用Hex-DCM混合體系，并對Hex-DCM不同配比時的混合溶劑的洗脫能力進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)洗脫溶劑Hex-DCM的配比為7∶3（V/V）時，所有目標(biāo)物的回收率均理想，且色譜峰的干擾較小; 當(dāng)DCM配比增加時，回收率無明顯提高而干擾峰增加。最終選擇DCM-Hex（3∶7， V/V）混合溶劑作為洗脫溶劑。

對洗脫溶劑的使用量進(jìn)行了優(yōu)化。洗脫溶劑使用量對回收率的影響見圖2， 采用1 × 5 mL混合溶劑洗脫目標(biāo)化合物，除1-OHP外，其余化合物回收率均高于90%， 使用3×5 mL混合溶劑時10種OH-PAHs的回收率均高于95.0%。因此洗脫次數(shù)最終設(shè)定為3次，優(yōu)化的洗脫液的體積為15 mL。

3.2?方法評價

尿液基質(zhì)為10例志愿者尿液的等體積混合液。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法考察本方法的回收率，由于混合尿液基質(zhì)中廣泛存在OH-PAHs，因此同時進(jìn)行加標(biāo)基質(zhì)和空白基質(zhì)的前處理，每個加標(biāo)濃度進(jìn)行6次重復(fù)實驗。從回收率、重復(fù)性及基質(zhì)效應(yīng)等3方面對建立的方法進(jìn)行評價，并與目前廣泛使用的固相萃取方法進(jìn)行對比。

評價方法中分別進(jìn)行低濃度（10 μg/L）、中濃度（50 μg/L）和高濃度（100 μg/L）的加標(biāo)實驗，同時依據(jù)文獻(xiàn)[11]中的報道，通過手動SPE裝置、全自動SPE裝置流程進(jìn)行尿液前處理，以便進(jìn)行比對。不同方法中目標(biāo)化合物的回收率見表2。結(jié)果表明，SLE前處理方法中，各目標(biāo)化合物在10、50與100 μg/L加標(biāo)濃度下的回收率在88.5%～120.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<6.7%; 手動SPE的回收率在804%～940%之間，自動SPE的回收率在76.8%～107.3%之間。 與手動SPE、自動SPE相比，本方法加標(biāo)回收率更高，穩(wěn)定性也較好。

通過混合尿液基質(zhì)加標(biāo)與溶劑標(biāo)樣同時檢測，基質(zhì)效應(yīng)計算公式如下：

其中， ME為基質(zhì)效應(yīng); Area1為混合基質(zhì)加標(biāo)后目標(biāo)物檢測的響應(yīng)峰面積; Area0為混合基質(zhì)中目標(biāo)物檢測的響應(yīng)峰面積; Area2為溶劑標(biāo)樣中目標(biāo)物檢測的響應(yīng)峰面積。ME<0，表示有基質(zhì)抑制效應(yīng); ME>0，表示有基質(zhì)促進(jìn)效應(yīng); ME=0，表示無基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明（表3），SLE各化合物的基質(zhì)效應(yīng)在4.1%之間，均呈現(xiàn)基質(zhì)抑制效應(yīng)，但除了2+3-OHF與1+9-OHPhe外，基質(zhì)效應(yīng)均較小。與手動SPE的44.2%～21.6%和自動SPE的74.9% ～39.1%相比，基質(zhì)效應(yīng)明顯降低。引起LC-MS/MS中基質(zhì)效應(yīng)的內(nèi)源性成分（如鹽、蛋白質(zhì)、肽類和磷脂等）在這些溶劑中不可溶。因此，分析物被洗脫下來，而基質(zhì)仍保留在硅藻土吸附劑的水相中，被有效地從最終萃取物中去除。

表4列出了所有分析物的回歸方程、重復(fù)性、檢測限和定量限。各化合物都呈現(xiàn)了良好的線性，相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.993。檢出限與定量限分別在0.06～0.3 μg/L和0.2～1.0 μg/L之間，各化合物的日內(nèi)（n=6）偏差與日間（n=6）偏差在1.6%～8.1%之間。OH-PAHS標(biāo)準(zhǔn)物的總離子流圖見圖3。

目前，用于OH-PAHs的檢測方法主要有HPLC、GC-MS和LC-MS/MS。方法的回收率和靈敏度除儀器自身的檢測能力外，前處理過程也在很大程度上影響分析方法的回收率及靈敏度。Jongeneelen等[29]采用SPE對尿樣中1-OHP進(jìn)行富集，回收率僅為 78%±2%，尿樣基質(zhì)干擾大。Campo等[12]用正己烷進(jìn)行LLE萃取，在此基礎(chǔ)上通過甲硅烷基化試劑進(jìn)行衍生化，GC-MS方法檢測的LOD在0.1～1.4 μg/L之間。Jacob等[14]采用戊烷-乙酸乙酯（9∶1， V/V）混合溶劑萃取出尿液樣品中的OH-PAHs，隨之將代謝物轉(zhuǎn)化為五氟芐基醚衍生物后， 利用LC-MS/MS進(jìn)行檢測， 方法靈敏度高，LOD可低至0.01～0.50 μg/L。但這些方法需要進(jìn)行分析物的衍生化，操作繁瑣耗時，衍生化反應(yīng)的穩(wěn)定性要求較高。Fan等[13]建立了一種利用戊烷和甲苯的混合溶劑萃取OH-PAHs的方法，減少了基質(zhì)干擾并顯著提高了方法靈敏度，LOD范圍為1.72～17.47 ng/L，但需要加入AgNO3溶液以降低PAH硫化物的干擾，操作相對較為復(fù)雜，不適用于流行病學(xué)大隊列的研究需求。本方法與文獻(xiàn)報道的其它方法相比，不需要進(jìn)行衍生化，操作簡單快速，且檢出限較低。

3.3?方法的實際應(yīng)用

應(yīng)用本方法對廣東省某小學(xué)志愿者的20例尿樣進(jìn)行了檢測。由表5可見，所有目標(biāo)物均有檢出，2-OHN是最主要的檢出化合物，最高濃度達(dá)到4.83 μg/L。目標(biāo)物的平均濃度分別為2-OHN 1.16 μg/L、1-OHN 0.62 μg/L、2+3-OHF 0.21 μg/L、2-OHPhe 0.08 μg/L、3-OHPhe 0.11 μg/L、1+9-OHPhe 0.10 μg/L、4-OHPhe 0.02 μg/L和1-OHP 0.15 μg/L。上述結(jié)果表明，本方法可用于人體尿液中OH-PAHs的檢測。

4?結(jié) 論

建立了SLE富集、凈化人體尿液中多種 OH-PAHs， 結(jié)合LC-MS/MS進(jìn)行檢測的方法。 建立的前處理技術(shù)無需對SLE柱進(jìn)行預(yù)活化，只需將2 mL尿液樣品酶解后載入柱中，用3×5 mL二氯甲烷和正己烷（3∶7，V/V）的混合溶劑進(jìn)行洗脫，方法簡單、快速。與目前廣泛使用的SPE等前處理技術(shù)相比，SLE方法具有回收率高且穩(wěn)定、生物基質(zhì)干擾較小等顯著優(yōu)勢，可滿足人體尿液中10種OH-PAHs的分析需求。

References

1?Campo L， Mercadante R， Rossella F， Fustinoni S. Anal. Chim. Acta， 2009， 631（2）： 196-205

2?U.S. Department of Health & Human Services， Public Health Service. J. Toxicol.-Cutan. Ocul.， 1999， 18（2）： 141-147

3?Yang B C， Fang S F， Wan X J， Luo Y， Zhou J Y， Li Y， Li Y J， Wang F， Huang O P. Anal. Chim. Acta， ?2017， ?973： 68-74

4?Strickland P， Kang D H. Toxicol. Lett.， ?1999， ?108（2-3）： 191-199

5?Li Z， Sandau C D， Romanoff L C， Caudill S P， Sjodin A， Needham L L， Patterson D G. Environ. Res.， ?2008， ?107（3）： 320-331

6?FU Hui， HU Xiao-Jian， CHEN Xi， LIN Shao-Bin. Chinese Journal of Chromatography， 2018， 36（5）： 487-492

付 慧， 胡小鍵， 陳 曦， 林少彬. 色譜， 2018， 36（5）： 487-492

7?Fan R F， Wang D L， Ramage R， She J W. Chem. Res. Toxicol.， ?2012， ?25（2）： 491-499

8?Zheng J H， Zheng W W， Zhou Y， Jiang S H， Spencer P， Ye W M， Zheng Y X， He G S， Qu W D. Environ. Sci. Technol.， ?2018， ?52（15）： 8866-8875

9?Onyemauwa F， Rappaport S M， Sobus J R， Gajdosová D， Wu R， Waidyanatha S. J. Chromatogr. B， ?2009， ?877（11-12）： 1117-1125

10?Smith C J， Huang W， Walcott C J， Turner W， Grainger J， Patterson D. Anal. Bioanal. Chem.， ?2002， ?372（1）： 216-220