依孜提·帕力哈提 馬建文 劉怡 張麗娟 李玉婷 王萍

摘要：目的 ?采用Box-Behnken響應面法，優(yōu)化健脾祛濕丸的水提工藝。方法 ?以丹酚酸B、多糖含量及浸膏得率的綜合評分為指標，在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面法考察浸泡時間、加水倍量和提取時間對水提工藝的影響。結果 ?最佳提取工藝為：浸泡1 h，加11倍量水，回流提取3次，每次1.20 h。結論 ?優(yōu)選的工藝方便、穩(wěn)定、可行，可為后續(xù)研究提供依據(jù)。

關鍵詞：健脾祛濕丸;水提工藝;丹酚酸B;多糖;Box-Behnken響應面法

中圖分類號：R283.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）05-0092-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.020 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Objective To optimize the water extraction process of Jianpi Qushi Concentrated Pills by using box-behnken response surface method. Methods Salvianolic acid B， total polysaccharide content and extract yield were set as the evaluation indexes. On the basis of single factor experiment results， the Box-Behnken response surface method was used to investigate the effects of soak time， adding water amount times and extracting time on the water extraction process. Results The optimum extraction technology was soaking for 1 h， with 11 times the amount of water extracted for three times， each time 1.20 h. Conclusion The optimum process is convenient， stable and feasible， which can provide references for follow-up study.

Keywords： Jianpi Qushi Concentrated Pills; water extraction process; salvianolic acid B; total polysaccharide; Box-Behnken response surface method

健脾祛濕丸處方來源于新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院皮膚科劉紅霞教授經(jīng)驗方，臨床用于脾虛濕盛所致的白疕（尋常型銀屑?。洳C為內(nèi)濕、外燥，燥濕共存、燥濕互化，這也是銀屑病不斷惡化、難以治愈的原因之一[1]。健脾祛濕丸由丹參、白花蛇舌草、甘草、茯苓等11味藥組成。方中丹參味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、養(yǎng)血安神、涼血消癰、清心除煩功效[2]。丹酚酸B為丹參中含量最高的水溶性活性成分，近年研究發(fā)現(xiàn)其在擴血管、抗血栓形成，改善微循環(huán)調(diào)節(jié)組織的修復與抑菌方面作用顯著，因此在皮膚病治療中的應用日益廣泛[3-5]。中藥多糖具有增強機體免疫功能及抗腫瘤等藥理作用，且?guī)缀鯖]有毒性，健脾祛濕丸處方中多味藥物含有多糖成分。

多糖作為中藥的主要活性成分之一，參與和介導了細胞各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)，特別在調(diào)節(jié)免疫功能方面尤為重要[6-7]。因原方以醫(yī)院制劑——散劑的形式在臨床應用多年，為提高藥物穩(wěn)定性，減少刺激性，遮蓋中藥散劑不良口感，方便患者服用，擬將此方開發(fā)為濃縮丸。

Box-Behnken響應面法是一種多因素非線性試驗條件優(yōu)選方法，可評估因素的非線性影響，在處方優(yōu)化中廣泛使用[8]。本試驗依據(jù)健脾祛濕丸處方的功能、主治及組方藥物的理化性質(zhì)，運用Box-Behnken響應面法優(yōu)化健脾祛濕丸的水提工藝，為本課題的后續(xù)研究奠定基礎。

1 ?儀器與試藥

Waters 2424高效液相色譜儀，美國Waters;SI-234電子天平（d=0.1 mg），丹佛儀器（北京）有限公司;Direct-QTM5型超純水儀，美國Millipore公司;DLSB-10/20低溫冷卻液循環(huán)泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Dl-820智能超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司;KDM型調(diào)溫電熱套，山東甄城光明儀器有限公司。

丹酚酸B對照品（批號111562-201313，純度97.0%），中國食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈為色譜純（Fisher），磷酸等其他試劑均為分析純，水為超純水。丹參、綿萆薢、薏苡仁、白花蛇舌草、茯苓等飲片均購于亳州市中正中藥材飲片有限公司，經(jīng)檢驗均符合2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）各藥項下有關規(guī)定。

2 ?方法與結果

2.1 ?丹酚酸B含量測定

2.1.1 ?色譜條件

色譜柱：XBridge Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;流動相：0.1%磷酸-乙腈（79∶21）;進樣量：10 ?L;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;檢測波長：286 nm[2]。色譜圖見圖1。

2.1.2 ?對照品溶液的制備

精密稱取適量丹酚酸B對照品，加甲醇-水（8∶2）混合溶液制成濃度為0.60 mg/mL的丹酚酸B對照品貯備液。

2.1.3 ?供試品溶液的制備

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，加10倍量水，加熱回流提取3次，每次1 h，合并提取液，取上清液30 mL，蒸干，加甲醇-水（8∶2）混合溶液溶解并定容至10 mL容量瓶，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 ?陰性對照溶液的制備

按處方量稱取除丹參外擬水提的藥物飲片，按“2.1.3”項下方法制備，即得。

2.1.5 ?線性關系考察

精密吸取“2.1.2”項下對照品貯備液，加甲醇分別稀釋至0.048、0.096、0.144、0.192、0.240 mg/mL，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=13 076 004.17X-12 390.2（r=0.999 8），表明丹酚酸B濃度在0.24～1.2 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.1.6 ?精密度試驗

精密吸取“2.1.2”項下對照品貯備液，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，計算得丹酚酸B峰面積RSD=0.82%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 ?重復性試驗

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，計算得丹酚酸B峰面積RSD=1.73%，表明本方法重復性良好。

2.1.8 ?穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件下分別于制備后0、6、8、12、24、48 h測定，計算得丹酚酸B峰面積RSD=1.17%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 ?加樣回收率試驗

取丹酚酸B含有量已知的供試品溶液6份，精密加入丹酚酸B對照品適量，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，結果平均回收率為97.57%，RSD=1.12%，表明加樣回收率良好。

2.2 ?總多糖含量測定

2.2.1 ?對照品溶液的制備

取D-無水葡萄糖對照品適量，加入超純水使其充分溶解，作為對照品貯備液（濃度為0.096 0 mg/mL）。

2.2.2 ?供試品溶液的制備

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，按擬定的試驗方案提取，備用。

2.2.3 ?苯酚溶液的制備

精密移取5 g苯酚溶液，用溫水溶解制成5%苯酚溶液，置于棕色量瓶中，低溫避光密封保存。

2.2.4 ?最大吸收波長的確定

精密吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.5 mL，供試品溶液0.1 mL，分別置100 mL量瓶中，加入超純水定容稀釋，充分搖勻后吸取稀釋液0.1 mL，置于10 mL試管中，用超純水補至1 mL，各加5%苯酚溶液1 mL及濃硫酸溶液5 mL，混勻，靜置10 min，放入沸水浴加熱20 min后取出，迅速冷卻至室溫，以相同方法制備空白液后進行測定，在210～800 nm波長區(qū)域掃描，結果見圖2?？梢?，在490.8 nm波長處，對照品及供試品溶液均有最大吸收[9]。

2.2.5 ?標準曲線的制備

分別精密吸取“2.2.1”項下對照品貯備液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，按上述顯色方法分別測定其吸光度。以吸光度（A）為縱坐標，D-無水葡萄糖濃度（C）為橫坐標，得回歸方程A=0.788C-0.069 4（r=0.999 7），結果表明D-無水葡萄糖在0.028 8～0.067 2 mg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.2.6 ?精密度試驗

精密吸取適量D-無水葡萄糖對照品溶液，按上述方法顯色后連續(xù)測定6次，得到RSD=0.25%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 ?重復性試驗

按擬定的試驗方案平行制備供試品溶液6份，在490.8 nm波長處測定按“2.2.4”項下方法顯色后的吸光度，得到RSD=1.05%，表明本方法重復性較好。

2.2.8 ?穩(wěn)定性試驗

精密移取0.1 mL按上述方法制備的供試品溶液，分別于制備后0、40、80、120、160、200、240 min按上述方法顯色，測定吸光度，結果RSD=0.343 9%，表明供試品溶液在4 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.2.9 ?加樣回收率試驗

取已知D-無水葡萄糖濃度的供試品溶液，取樣品與對照品含量為l∶1平行制備6份待測溶液，按上述方法顯色并測定其吸光度，結果平均加樣回收率為100.17%，RSD=0.48%，表明加樣回收率良好。

2.3 ?浸膏得率測定

將50 mL水提液精密吸取至已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后放入105 ℃烘箱內(nèi)干燥3 h，置于干燥器冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計算其浸膏得率[10]。浸膏得率（%）=浸膏質(zhì)量×供試品溶液體積÷提取藥物飲片的總質(zhì)量×移取供試品溶液體積×100%。

2.4 ?提取工藝研究

以浸泡時間、加水倍量和提取時間為自變量，以丹酚酸B、總多糖含量和浸膏得率的綜合評分為因變量，根據(jù)評價指標對水提工藝的影響擬定權重，以綜合評分作為提取效果的評判依據(jù)。根據(jù)各指標對水提工藝的影響，給予丹酚酸B含量40%的權重比例，總多糖含量和浸膏得率各給予30%的權重比例，分別測定各指標成分含量并計算綜合評分。即：丹酚酸B含量評分=丹酚酸B含量÷最大丹酚酸B含量×40，總多糖含量評分=總多糖含量÷最大總多糖含量×30，浸膏得率評分=浸膏得率÷最大浸膏得率×30，綜合評分=丹酚酸B含量評分+總多糖含量評分+浸膏得率評分。

2.4.1 ?單因素試驗

分別對提取次數(shù)、浸泡時間、加水倍量、提取時間進行單因素試驗，根據(jù)單因素試驗結果來確定Box-Behnken響應面試驗的因素水平范圍[11]。

2.4.1.1 ?提取次數(shù)考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將浸泡時間固定為0.5 h，加水倍量固定為10倍，提取時間固定為1 h，依次考察提取1、2、3次的結果，測得綜合評分呈遞增趨勢（見圖3），故最佳提取次數(shù)為3次。

2.4.1.2 ?浸泡時間考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將提取次數(shù)固定為1次，加水倍量固定為10倍，提取時間固定為1.0 h，依次考察浸泡0.5、1.0、1.5、2.0 h的綜合評分，結果測得浸泡時間為1.0 h時綜合評分最高（見圖4）。故選擇最佳浸泡時間為1.0 h，將浸泡0.5、1.0、1.5 h作為響應面設計范圍。

2.4.1.3 ?加水倍量考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將提取次數(shù)固定為1次，浸泡時間固定為0.5 h，提取時間固定為1.0 h，依次考察加水6、8、10、12倍的綜合評分。當加水倍量為10倍時，綜合評分最高（見圖5），故選擇最佳加水倍量為10倍，將8、10、12加水倍量作為響應面設計范圍。

2.4.1.4 ?提取時間考察

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，將提取次數(shù)固定為1次，浸泡時間固定為0.5 h，加水倍量為10倍，依次考察提取0.5、1.0、1.5、2 h的綜合評分，當提取時間為1 h時，綜合評分達到最高（見圖6），故選擇最佳提取時間為1.0 h，將提取時間0.5、1.0、1.5 h為響應面設計范圍。

2.4.2 ?Box-Behnken響應面試驗

稱取處方中擬水提的藥物飲片91 g，提取次數(shù)固定為3次，以浸泡時間、加水倍量和提取時間為考察指標進行Box-Behnken響應面設計，試驗因素與水平見表1。采用Design-Expert8.0.4軟件設計試驗方案，結果見表2，方差分析見表3，響應面圖見圖7。

2.4.3 ?模型擬合

采用方差分析對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程Y=90.55-0.56A+5.31B+2.67C+4.22AB+4.10AC+2.27BC-9.13A2-8.34B2-4.16C2。從表3方差分析結果可以看出：B因素及因素之間的交互影響AB、AC、A2、B2、C2對綜合評分具有顯著影響，其影響程度為B>C>A;失擬項P>0.05，說明失擬不顯著，因此所得回歸方程能較好地分析及預測該研究的水提工藝。

2.4.4 ?驗證試驗

通過回歸方程進行數(shù)據(jù)分析，得到最佳提取工藝條件為：稱取處方中擬水提的物飲片91 g，浸泡時間為1.10 h，加10.88倍量水，提取1.27 h。結合實際生產(chǎn)和成本節(jié)約，確定最佳工藝為：稱取處方中擬水提的藥物飲片9 g，浸泡時間為1.00 h，加11.00倍量水，提取1.20 h。按優(yōu)選的提取工藝進行3次驗證試驗，結果綜合評分為90.54，與預測值（92.38）接近，且丹酚酸B轉移率為72.46%，總多糖轉移率為84.37%，表明該模型預測性較好，可用于優(yōu)化健脾祛濕丸的水提工藝[12]。

3 ?討論

銀屑病是一種多基因遺傳背景下T細胞異常的免疫性慢性皮膚病。中藥治療具有不良反應少、效果良好等優(yōu)點，故在免疫性疾病的治療中受到越來越多的關注。中藥多糖對巨噬細胞、T細胞均有明顯調(diào)節(jié)作用[13]。薏苡仁多糖可顯著提高免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)[14];茯苓多糖可在炎性疾病中激活T細胞向Treg分化，調(diào)節(jié)機體的免疫失衡[15-16];丹參多糖可顯著抑制誘導型一氧化氮合酶、干擾素-α及白細胞介素-1β基因表達，具有保護機體免受細胞因子過量表達而受到損傷的作用，顯示出較好的免疫調(diào)節(jié)活性[17];甘草多糖可誘導小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生一氧化氮，避免脂多糖干擾，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[18]。

健脾祛濕丸方中丹參的有效成分包括脂溶性與水溶性兩部分。以丹參酮為代表的醌類化合物為主要的脂溶性成分，丹參酮類化合物具有脂溶性高、半衰期短和生物利用度低等缺點，故臨床應用受到限制。酚酸類是主要的水溶性成分，且以丹酚酸B含量最高，在丹參的功效作用中占有重要地位，故以其作為指標性成分。本研究參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）丹參項下HPLC測定方法，以乙腈- 0.1%磷酸（22∶78）作為流動相對丹酚酸B含量進行測定，發(fā)現(xiàn)分離度不符合要求，故將流動相比例調(diào)整為21∶79。

本研究在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化健脾祛濕丸水提工藝，所建立的模型預測性較好，最佳提取工藝為：浸泡1 h，加11倍量水，回流提取3次，每次1.20 h。

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（收稿日期：2018-09-17）

（修回日期：2018-10-08;編輯：陳靜）