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        血清microRNA-4286表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系及其臨床意義*

        2019-07-01 02:22:50郭紅艷高勇張春晶李淑艷吳琦黃常志孫曉杰
        關(guān)鍵詞:胃癌血清

        郭紅艷,高勇,張春晶,李淑艷,吳琦,黃常志,孫曉杰

        (1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三 附屬醫(yī)院 檢驗科,黑龍江 齊齊哈爾 161002;3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 腫瘤醫(yī)院 分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室,北京 100021)

        胃癌是世界第3 大癌癥死亡原因,約50%胃癌發(fā)生在中國,且年輕患者死亡率呈逐年上升的趨勢[1-2]。 microRNAs(miRNAs)與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,是新型基因診斷標志物[3-4]。MicroRNA-4286(miR-4286)定位于人類染色體8p23.1,在惡性黑色素瘤等腫瘤組織中表達上調(diào)[5-6],但miR-4286 在胃癌中的表達及其與胃癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系國內(nèi)外卻未見報道。本文通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR)檢測胃癌血清樣本中miR-4286 的表達,分析其與胃癌臨床病理特征的關(guān)系,初步探討其對胃癌的臨床診斷效能及意義。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料

        選取2017年3月—2017年6月在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院住院的胃癌患者(胃癌組,84 例)和健康體檢者(對照組,60 例)。其中對照組男性19 例,女性41 例,平均年齡(48.71±10.53)歲;胃癌組男性66 例,女性18 例,平均年齡(59.57±9.28)歲。胃癌組樣本在收集前患者均未進行手術(shù)、放療和化療等相關(guān)治療。癌癥診斷和腫瘤分期根據(jù)手術(shù)結(jié)果,按照美國癌癥聯(lián)合委員會癌癥的TNM 分期系統(tǒng)第6版確定[2]。不適合手術(shù)治療的患者,通過組織活檢及影像學(xué)檢查確定臨床診斷和腫瘤分期。本研究經(jīng)過本院倫理會批準,所有研究對象簽署知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1 血清標本收集 用血清收集管分別收集5 ml胃癌組和對照組靜脈血,室溫靜止1 h 后,4 ℃、3 500 r/min 離心10 min。將上層血清轉(zhuǎn)移到新的收集管,4℃、16 000 r/min 離心10 min,除去細胞碎片,于-80℃保存。

        1.2.2 血清總RNA 提取 采用Trizol LS 試劑(美國Invitrogen 公司)從血清中提取總RNA,按照試劑盒說明書進行操作。取250μl 血清,加入750μl Trizol LS,室溫裂解后分別加入三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇(北京化工廠)等試劑提取總RNA,用10μl RNase free ddH2O(美國Sigma公司)溶解RNA,于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 qRT-PCR 將 血 清 總RNA 采 用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis 和SYBR qRT-PCR 試劑盒(日本TaKaRa 公司)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為10μl,包含5.00μl mRQ 緩沖液、1.25μl mRQ 酶、3.75μl RNA 模板,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃、60 min,85℃、5 min。反應(yīng)生成的cDNA 模板10 倍稀釋后進行qRT-PCR。PCR 反應(yīng)體系總體積20μl,miR-4286 正向引物由美國Invitrogen 公司合成,引物序列:5’-ACCCCACTCCTGGTACC-3’,通用引物和U6 引物均為試劑盒自帶。使用QuantStudioTM7 Flex qRT-PCR 儀(美國ABI 公司)進行PCR 擴增,反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 s,95℃變性5 s,60℃退火及延伸20 s,共40 個循環(huán)。每個樣品設(shè)置3 個復(fù)孔,以U6 為內(nèi)參照基因,基因相對表達量采用2-ΔΔCt法計算。

        1.2.4 腫瘤標志物的檢測 采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏公司)測定血清樣本中腫瘤標志物癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、糖類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9,CA19-9)和糖類抗原72-4(carbohydrate antigen 72-4,CA72-4)的表達量,檢測結(jié)果通過查閱臨床病例資料獲得,上限值分別為5.0 ng/ml、39 u/ml 和8.2 u/ml。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

        數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,非正態(tài)分布的計量資料用非參數(shù)秩和檢驗(Mann-Whitney U);計數(shù)資料以率或百分比表示,用Fisher 確切概率法;繪制受試者工作特征曲線(ROC),P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 胃癌患者血清miR-4286 表達升高

        qRT-PCR 結(jié)果顯示,miR-4286 在對照組和胃癌組患者血清中的表達量分別為(1.810±2.099)和(4.707±4.649),經(jīng)秩和檢驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-4.644,P=0.000),胃癌組平均升高2.601 倍。 見圖1。

        圖1 兩組miR-4286 表達水平比較

        2.2 miR-4286 的ROC 曲線診斷性能

        繪制ROC 曲線,計算出約登指數(shù),最大約登指數(shù)的對應(yīng)值即為最佳預(yù)測值(Cut off 值)。經(jīng)計算確定Cut off 值為3.381,此時曲線下面積(AUC)為0.727(95%CI:0.645,0.810),敏感性和特異性分別為48.8%和88.3%。以3.381為診斷閾值(即危險分數(shù)),將樣本劃分為兩組,即高危險風險組和低危險風險組,前者代表胃癌患者,后者健康體檢者,進行危險分數(shù)分析,結(jié)果顯示血清miR-4286 診斷胃癌的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為0.872 和0.557。見表1和圖2。

        2.3 血清miR-4286 表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

        將胃癌組根據(jù)性別、年齡、TNM 分期及病理分化程度等進行分類統(tǒng)計。Fisher 確切概率法結(jié)果表明,miR-4286 表達水平與腫瘤分化程度相關(guān)(P<0.05),與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、臨床分期無關(guān)(見表2)。秩和檢驗結(jié)果顯示,胃癌血清中miR-4286 的表達量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、遠處轉(zhuǎn)移與否及腫瘤臨床分期(Ⅰ~Ⅳ)無關(guān)(Z=-1.270、-1.432 和-1.218,P=0.204、0.152和0.223),但其在低分化胃癌患者血清中的表達量高于中、高分化胃癌患者(Z=-2.661,P=0.008)(見 圖3)。

        表1 胃癌患者和健康對照者的危險分數(shù)分析

        圖2 miR-4286 的ROC 曲線

        表2 胃癌臨床因素與miR-4286 表達水平的關(guān)系 例

        2.4 腫瘤標志物CA19-9、CEA 和CA72-4 在胃癌患者血清中的表達

        通過查閱病例,對胃癌組和對照組樣本的腫瘤標志物CA19-9、CEA 和CA72-4 檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。秩和檢驗結(jié)果顯示,胃癌血清中CA72-4 表達量較對照組升高(Z=-3.324,P=0.001);兩組CA19-9和CEA 比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.315 和-1.400,P=0.188 和0.161)(見圖4)。ROC 曲線結(jié)果顯示,CA19-9、CEA 和CA72-4 診斷胃癌的AUC 分別為0.574(95% CI:0.465,0.683)、0.579(95% CI:0.469,0.689)和0.691(95% CI:0.587,0.795)(見 圖5)。

        2.5 miR-4286 與CA72-4 對胃癌診斷的效能比較

        以病理診斷為金標準,將miR-4286 與腫瘤標志物CA72-4 對胃癌的診斷效能進行比較,結(jié)果顯示,miR-4286 診斷胃癌的特異性和陽性預(yù)測值高于臨床常用腫瘤標志物CA72-4。見表3。

        圖3 miR-4286 表達水平與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 (±s)

        圖4 兩組腫瘤標志物的表達水平比較

        圖5 CA19-9、CEA、CA72-4 的ROC 曲線

        表3 血清miR-4286、CA72-4 診斷胃癌的敏感性和特異性比較

        3 討論

        miRNA 是通過干擾1 個或多個靶mRNA 的翻譯來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因表達的微小非編碼RNA,參與細胞生長、增殖、分化、凋亡和衰老等生理、病理過程[7]。 miRNA 通過影響癌基因和腫瘤抑制基因的表達成為人類致癌的重要調(diào)節(jié)因子,其異常調(diào)節(jié)可能與所有類型癌癥的發(fā)病機制相關(guān)[8-9],其表達水平在胃癌等多種惡性腫瘤中可作為潛在的診斷和預(yù)后生物標志物[10-12]。

        miR-4286 是近年來發(fā)現(xiàn)的miRNAs,其在惡性黑色素瘤及食管癌組織中表達升高,miR-4286 通過靶向INPP4A基因激活JAK2/STAT3 信號通路,促進食管癌的發(fā)生,與食管癌患者的預(yù)后生存期高風險密切相關(guān),有望成為食管癌治療的靶點[13-14]。但miR-4286與其他腫瘤發(fā)生及診斷預(yù)后的關(guān)系未見報道。本研究通過qRT-PCR 實驗發(fā)現(xiàn),miR-4286 在胃癌血清中的表達量高于對照組,且其表達水平與腫瘤分化程度相關(guān)。筆者據(jù)此推測,miR-4286 可能參與胃癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化過程,但其發(fā)揮作用的分子機制還需進一步實驗研究。

        目前臨床常用的胃腸道腫瘤標志物主要有CEA、CA19-9 和CA72-4,但其對胃癌診斷的敏感性和特異性都不高,如LIANG 等[15]對2 288 例胃癌患者和1 869 例對照組進行分析,發(fā)現(xiàn)CEA、CA19-9 和CA724 獨立診斷胃癌的敏感性僅為20.1%~27.6%,而3 者聯(lián)合診斷可將敏感性提高至48.2%。YU 等[16]對216 例胃癌患者的臨床檢測結(jié)果進行統(tǒng)計,結(jié)果CEA、CA19-9 和CA72-4 獨立診斷的敏感性分別為22.69%、18.98%和22.69%,而3 者聯(lián)合診斷的敏感性達44.91%。GUO 等[17]對1 566 例胃癌患者的臨床檢測結(jié)果進行ROC 曲線分析,結(jié)果CEA、CA19-9 和CA724 區(qū)分胃癌和健康人的AUC 分別為0.582、0.571和0.544。本研究發(fā)現(xiàn),CA724 診斷的AUC 為0.691,高于文獻報道[17],但其獨立診斷的敏感性和特異性分別為31.57%和55.95%,作為診斷標志物導(dǎo)致較高的漏診率;而miR-4286 診斷胃癌的AUC 為0.727,診斷的特異性高達90%,陽性預(yù)測值為0.872,高于CA72-4,因此可能具有潛在的臨床應(yīng)用前景。

        目前非編碼RNA 的研究正如火如荼,由于循環(huán)miRNAs 反映癌癥進展的狀態(tài),且其穩(wěn)定性較好,因此可能是癌癥快速檢測和治療的潛在生物標志物[18]。本研究初步探討miR-4286 的表達水平與胃癌的關(guān)系,為闡明miR-4286 的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ),至于miR-4286 的表達是否具有組織或器官特異性,以及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用的分子機制,還需更深入的基礎(chǔ)研究及大規(guī)模的臨床樣本進行驗證。

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