孫光源，武亮，張?jiān)?，薛軍，史玉潔，李文賢

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.普外科，2.手術(shù)室，3.乳腺外科，河北 張家口 075000；張家口市第一醫(yī)院 4.藥劑科，5.內(nèi)分泌科，河北 張家口 075100）

結(jié)腸癌發(fā)病率居惡性腫瘤第3 位[1]。近年來(lái)我國(guó)結(jié)腸癌發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)[2]。劉清安等[3]報(bào)道指出,我國(guó)結(jié)腸癌患者5年生存率約為32%，因此深入探討結(jié)腸癌進(jìn)展的影響因素十分重要。WWP1 蛋白主要定位于細(xì)胞漿，在乳腺癌[4]、前列腺癌[5]等惡性腫瘤中起促癌作用。而癌基因C-myc表達(dá)C-myc 蛋白主要定位于細(xì)胞核，也可見于細(xì)胞質(zhì)，可調(diào)控癌基因p53家族的表達(dá)，加速乳腺癌的進(jìn)展[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2017年12月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的135 例結(jié)腸癌患者的石蠟標(biāo)本。所選標(biāo)本由結(jié)腸癌根治術(shù)術(shù)中獲取，結(jié)腸癌標(biāo)本取自腫瘤組織中央非壞死區(qū)域，癌旁正常組織標(biāo)本取自距離腫瘤組織＞5 cm 非腫瘤組織。其中，男性71 例，女性64 例；年齡＜55 歲42 例，≥55 歲93 例；腫瘤位于右半結(jié)腸58 例，左半結(jié)腸77 例；腫瘤直徑＜5 cm 96 例，≥5 cm 39 例；腫瘤分化程度：高分化者11 例，中分化者61 例，低分化者63 例；Dukes 分期：A 期51 例，B 期14 例，C 期70 例，未納入D 期患者；浸潤(rùn)深度：T1、T2者84 例，T3、T4者51 例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65 例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理科確診為原發(fā)性結(jié)腸癌；②患者病歷、隨訪資料完整，組織蠟塊標(biāo)本保存完好；③未合并其他惡性腫瘤；④未 合并其他影響免疫組織化學(xué)結(jié)果的嚴(yán)重疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病歷資料、組織蠟塊標(biāo)本缺失及污損，出院后失訪；②手術(shù)時(shí)年齡≥70 歲；③外科手術(shù)前已接受其他抗腫瘤手段治療；④其他生化指標(biāo)異常。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 免疫組織化學(xué)法

1.2.1 主要試劑 即用型二抗SP 試劑盒（上海優(yōu)予生物科技有限公司），WWP1、C-myc 免疫組織化學(xué)法所用一抗分別為鼠抗人WWP1 單克隆抗體、鼠抗人C-myc 蛋白單克隆抗體（美國(guó)Novus 生物有限公司），二抗為生物素化兔抗鼠IgG（美國(guó)Boster 公司），辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵蛋白素（上海優(yōu)予生物科技有限公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果判定 將石蠟標(biāo)本以4μm 為間隔進(jìn)行連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟水化，滴加3%過(guò)氧化氫H2O2室溫孵育20 min，加入乙二胺四乙酸抗原修復(fù)液后，微波修復(fù)20 min。待切片自然冷卻，加入一抗，4℃孵育過(guò)夜。待切片恢復(fù)至室溫，滴加二抗工作液，37℃孵育10 min。滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉素卵蛋白素，37℃孵育10 min。二氨基聯(lián)苯胺法顯色，蘇木精復(fù)染。常規(guī)脫水、制片及封膠。本研究陰性對(duì)照均采用磷酸緩沖鹽溶液替代一抗。染色結(jié)果由2 位病理科醫(yī)師獨(dú)立判斷，取組織切片于200 倍光鏡下，取5 個(gè)不同視野，每個(gè)視野含≥100 個(gè)細(xì)胞，最終結(jié)果取各視野評(píng)分的算術(shù)平均數(shù)。將結(jié)果分為染色評(píng)分與計(jì)數(shù)評(píng)分。①染色評(píng)分：無(wú)染色計(jì)0 分，淺黃色至黃色計(jì)1 分，黃棕色計(jì)2 分，紅棕色至褐色計(jì)3 分；②計(jì)數(shù)評(píng)分：染色細(xì)胞＜6%計(jì)0 分，6%～33%計(jì)1 分，34%～66%計(jì)2 分，＞66%計(jì)3 分。將染色評(píng)分×計(jì)數(shù)評(píng)分作為總分，總分＜2 分為表達(dá)陰性，≥2 分為陽(yáng)性。

1.3 隨訪

以患者出院為觀察起點(diǎn)，利用電話等電子通訊手段，結(jié)合患者復(fù)診病歷，對(duì)患者及家屬進(jìn)行隨訪。對(duì)納入患者生存情況、治療情況及死亡原因等各種出院后的情況進(jìn)行登記，所有患者登記無(wú)進(jìn)展生存期（progress free survival,PFS）與總生存期（overall survival,OS）。隨訪截止于2018年7月31日，隨訪時(shí)長(zhǎng)7～65 個(gè)月，平均（32.39±14.50）個(gè)月，中位隨訪時(shí)長(zhǎng)30 個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法繪制PFS 和OS 比率，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；影響因素分析用多因素Cox 回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸組織中WWP1、C-myc 的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織WWP1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為74.81%，癌旁正常組織WWP1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為21.48%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=76.905，P=0.000）；結(jié)腸癌組織WWP1 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織。結(jié)腸癌組織C-myc蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為67.41%，癌旁正常組織C-myc 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為8.89%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=97.963，P=0.000）；結(jié)腸癌組織C-myc 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁正常組織。見圖1。

圖1 結(jié)腸組織中WWP1、C-myc 蛋白的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×200）

2.2 不同影響因素的結(jié)腸癌組織中WWP1、C-myc 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

結(jié)腸癌組織WWP1、C-myc 蛋白表達(dá)受患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑及腫瘤分化程度的影響較小（P＞0.05），而受腫瘤Dukes 分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響較大（P＜0.05）。見表1。

表1 不同影響因素的結(jié)腸癌組織中WWP1、C-myc 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

續(xù)表1

2.3 結(jié)腸癌組織WWP1、C-myc 表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響

2.3.1 結(jié)腸癌組織WWP1 表達(dá)對(duì)患者PFS 的影響 結(jié)腸癌組織中，WWP1 陰性表達(dá)組隨訪期間PFS 比率為61.76%，平均PFS（46.07±3.99）個(gè)月；而WWP1陽(yáng)性表達(dá)組隨訪期間PFS 比率為27.72%，平均PFS（28.53±1.98）個(gè)月。兩組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.749，P=0.000），WWP1陰性表達(dá)組PFS 比率較高。見圖2。

2.3.2 結(jié)腸癌組織C-myc 表達(dá)對(duì)患者PFS 的影響 結(jié)腸癌組織中，C-myc 陰性表達(dá)組隨訪期間PFS 比率為56.82%，平均PFS（42.86±3.57）個(gè)月；而C-myc陽(yáng)性表達(dá)組隨訪期間PFS 比率為26.37%，平均PFS（28.43±2.10）個(gè)月。兩組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.889，P=0.001），C-myc 陰性表達(dá)組PFS 比率較高。見圖2。

2.3.3 結(jié)腸癌組織WWP1 表達(dá)對(duì)患者OS 的影響 結(jié)腸癌組織中，WWP1 陰性表達(dá)組隨訪期間OS 比率為76.47%，平均OS（54.72±3.02）個(gè)月；而WWP1陽(yáng)性表達(dá)組隨訪期間OS 比率為47.52%，平均OS（39.55±2.22）個(gè)月。兩組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.605，P=0.003）；WWP1 陰性表達(dá)組OS 比率較高。見圖3。

2.3.4 結(jié)腸癌組織C-myc 表達(dá)對(duì)患者OS 的影響 結(jié)腸癌組織中，C-myc 陰性表達(dá)組隨訪期間OS 比率為72.73%，平均OS（51.78±3.10）個(gè)月；而C-myc陽(yáng)性表達(dá)組隨訪期間OS 比率為46.15%，平均OS（39.68±2.30）個(gè)月。兩組比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.456，P=0.004）；C-myc 陰性表達(dá)組OS 比率較高。見圖3。

圖2 結(jié)腸癌組織中WWP1、C-myc 表達(dá)對(duì)患者PFS 的影響

圖3 結(jié)腸癌組織中WWP1、C-myc 表達(dá)對(duì)患者OS 的影響

2.4 Cox 回歸分析結(jié)腸癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素

建立Cox 回歸分析模型，以結(jié)腸癌患者預(yù)后作為應(yīng)變量，列示的各指標(biāo)變量作為自變量（見表1），以全子集回歸方式將其納入回歸。結(jié)果顯示，影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素有分化程度、腫瘤Dukes 分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WWP1 表達(dá)及C-myc 表達(dá)（P＜0.05）。見表2。

表2 Cox 回歸分析結(jié)腸癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的相關(guān)參數(shù)

3 討論

結(jié)腸癌早期臨床癥狀隱匿，≥50%結(jié)腸癌患者初次就診時(shí)已出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，造成預(yù)后差[7]。早期診斷、合理治療是提高結(jié)腸癌患者預(yù)后的研究方向。

許多研究將泛素連接酶作為尋找惡性腫瘤治療靶點(diǎn)的研究重點(diǎn)[8-10]。WWP1 屬于E3 泛素連接酶，可調(diào)控轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）[11]、10 號(hào)染色體同源丟失性磷酸張力蛋白基因[12]相關(guān)的信號(hào)通路，下調(diào)蠕蟲果蠅母抗同源蛋白（Smad）[13]，調(diào)節(jié)鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子5[14]，發(fā)揮促癌基因樣作用。體外研究結(jié)果表明，WWP1 能泛素化Smad4 蛋白和TGF-β 受體[15]。本研究結(jié)果可推斷，WWP1 對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲過(guò)程有促進(jìn)作用。

C-myc基因編碼蛋白質(zhì)是一種短半衰蛋白，對(duì)機(jī)體的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等具有調(diào)控作用。病理狀態(tài)下，C-myc 可調(diào)控癌基因p53家族的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展[16]；同時(shí)在肺癌[17]及骨肉瘤[18]等惡性腫瘤中也呈高表達(dá)，具有一定的診斷價(jià)值。本研究結(jié)果表明，C-myc 在結(jié)腸癌組織中同樣出現(xiàn)促癌基因樣作用，可作為結(jié)腸癌診斷相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。但關(guān)于乳腺癌的研究顯示，C-myc基因與乳腺癌的分化程度、病理分型相關(guān)[16]。而本研究結(jié)果中C-myc 的表達(dá)卻與結(jié)腸癌的分化程度無(wú)關(guān)，這可能由于乳腺癌同時(shí)受性激素受體調(diào)節(jié)，C-myc 與雌激素受體存在相互作用，而結(jié)腸癌受性激素影響較小。由本研究結(jié)果可推測(cè)，C-myc 在結(jié)腸癌中的作用位點(diǎn)近似于骨肉瘤中，即與TGF-β 受體相關(guān)[18]，但需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

C-myc基因表達(dá)產(chǎn)物的主要降解途徑是泛素連接酶系統(tǒng)[19-21]。而WWP1 屬于E3 泛素連接酶。本研究結(jié)果可推測(cè)，WWP1 在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制可能是泛素化降解C-myc 蛋白。然而WWP1 作用位點(diǎn)眾多，C-myc 可能僅是其中一個(gè)通路，其他的路徑仍然有待后續(xù)研究探明。

隨訪結(jié)果顯示，由于WWP1、C-myc 能促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，因此其陽(yáng)性表達(dá)的結(jié)腸癌組織惡性程度較高，易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。所以監(jiān)測(cè)結(jié)腸癌組織中WWP1、C-myc 表達(dá)不僅對(duì)結(jié)腸癌的診斷具有參考價(jià)值，而且可作為對(duì)患者預(yù)后評(píng)估的參考。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中WWP1、C-myc 表達(dá)均異常高表達(dá)，且與結(jié)腸癌的侵襲、遷移密切相關(guān)。結(jié)腸癌組織中WWP1、C-myc 陽(yáng)性表達(dá)患者的預(yù)后較差，且WWP1、C-myc 高表達(dá)是影響結(jié)腸癌患者術(shù)后生存期的危險(xiǎn)因素。因此推斷WWP1、C-myc 可能共同參與結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展，可作為結(jié)腸癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)。