周冰 李煥娟 楊會鮮

摘要 [目的]建立并驗(yàn)證雙葛止瀉口服液中綠原酸的含量測定方法。[方法]采用Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液梯度洗脫;檢測波長為327 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃。[結(jié)果]綠原酸進(jìn)樣量在0.082 5～0.825 0 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 0.999 9），平均回收率為104.0%，RSD為0.4%。[結(jié)論]該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于雙葛止瀉口服液中綠原酸的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 綠原酸;雙葛止瀉口服液;高效液相色譜法

中圖分類號 R286文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0167-03

Abstract [Objective] The method for determination of the content of chlorogenic acid in Shuangge antidiarrhea oral liquid was developed and validated. [Method] The analysis was performed on an Agilent ZORBAX SBC18 column（150 mm×4.6 mm， 5 μm）. The gradient mobile phase was consisted of acetonitrile -0.4% phosphoric acid solution， and the detection wavelength was 327 nm. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 25 ℃. [Result] The linear range of the calibration curves for chlorogenic acid was 0.082 5-0.825 0 μg （r = 0.999 9）， and the average recovery was 104.0% with RSD of 0.4%. [Conclusion] The method is simple and accurate with high specificity， which can be used to determine the content of chlorogenic acid in Shuangge Antidiarrhea oral liquid.

Key words Chlorogenic acid;Shuangge antidiarrhea oral liquid;HPLC

雙葛止瀉口服液是由金銀花、葛根、黃芩等6味中藥采用現(xiàn)代提取工藝，經(jīng)離心純化，加入輔料，滅菌而制成的口服液制劑。臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，本方具有清熱燥濕、解毒止瀉的功效，可用于仔豬濕熱泄瀉。本方是在中醫(yī)古籍《傷寒論》中經(jīng)典方劑“葛根芩連湯”的基礎(chǔ)上，通過組方加減、工藝優(yōu)化、劑型改進(jìn)而制成的中獸藥制劑。金銀花為本方的君藥，性甘寒，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能。現(xiàn)代研究表明，金銀花具有解熱、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等藥理作用，其中綠原酸是金銀花中的主要功效成分[1-5]。

由于該制劑為中獸藥復(fù)方新制劑，目前尚無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為了更好地控制該制劑的質(zhì)量，筆者采用高效液相色譜梯度洗脫法，建立雙葛止瀉口服液中綠原酸的含量測定方法，并對該方法進(jìn)行耐用性研究，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。Waters e2695型高效液相色譜儀，配2489型紫外檢測器（美國Waters公司）;AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

1.1.2 試藥與試劑。綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201415，含量96.2%）、雙葛止瀉口服液（洛陽惠中獸藥有限公司，批號20170201、20170202、20170203，規(guī)格：每1 mL相當(dāng)于原生藥0.45 g）;乙腈，HPLC級，Thermo Fisher Scientific公司;磷酸，HPLC級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;水為超純水。

1.2 方法

1.2.1

色譜條件與系統(tǒng)適用性。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150? mm× 4.6 mm，5 μm）;梯度洗脫，流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（0～12 min，乙腈11%;12～13 min，乙腈由11%上升至40%;13～18 min，乙腈40%;18～19 min，乙腈由40%下降至11%;19～25 min，乙腈11%），流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長327 nm;進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

1.2.2 對照品貯備液的制備。取綠原酸對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得（10 ℃以下保存）。

1.2.3 對照品溶液的制備。精密吸取對照品貯備液5 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，即得（10 ℃以下保存）。

1.2.4 供試品溶液的制備。精密量取本品2 mL，置50 mL容量瓶中，加10%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.5 陰性對照溶液的制備。按處方制備缺金銀花的陰性對照樣品，按“1.2.4”方法制成陰性對照溶液，即得。

1.2.6 方法學(xué)考察。

1.2.6.1 專屬性考察。分別取“1.2.3”項(xiàng)下對照品溶液、“1.2.4”項(xiàng)下供試品溶液及“1.2.5”項(xiàng)下陰性對照溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按“1.2.1”色譜條件測定并記錄色譜圖。

1.2.6.2 線性關(guān)系考察。取“1.2.3”項(xiàng)下對照品溶液，分別精密吸取2、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、綠原酸的進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.2.6.3 精密度試驗(yàn)。取“1.2.3”項(xiàng)下對照品溶液，按“1.2.1”色譜條件，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，測定峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)。取雙葛止瀉口服液（批號20170201），按照“1.2.4”方法制備供試品溶液，分別制備6份，測定峰面積并計(jì)算含量及RSD。

1.2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取雙葛止瀉口服液（批號20170201），按照“1.2.4”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測定峰面積并計(jì)算RSD。

1.2.6.6 加樣回收率試驗(yàn)。取已知含量的雙葛止瀉口服液樣品6份（批號20170201，綠原酸含量1.01 mg/mL），每份1 mL，置50 mL容量瓶中，各精密加入“1.2.2”項(xiàng)下對照品貯備液5 mL，按照“1.2.4”方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積并計(jì)算含量及加樣回收率。

1.2.7 耐用性。

為了考察色譜條件發(fā)生小的變動(dòng)時(shí)測定結(jié)果受影響的程度，分別考察流動(dòng)相比例、柱溫、流速及色譜柱型號發(fā)生變化時(shí)樣品含量的變化情況。按“1.2.3”和“1.2.4”方法分別制備對照品溶液與供試品溶液，采用單因素法，每次變動(dòng)其中一個(gè)因素，固定其他因素為中間條件，依法測定含量，并計(jì)算每個(gè)因素下含量測定結(jié)果的RSD。

1.2.8 樣品測定。

取雙葛止瀉口服液樣品（批號20170201、20170202、20170203），按“1.2.4”方法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，依法測定并計(jì)算樣品中綠原酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性考察。按“1.2.6.1”方法進(jìn)行操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），供試品溶液在與綠原酸對照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性對照在與綠原酸對照品色譜相應(yīng)的位置處無色譜峰，說明該方法專屬性較好。

2.1.2 線性關(guān)系考察。按“1.2.6.2”方法進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，結(jié)果得出綠原酸的回歸方程為Y=3 128 437.351 7X-48 317.243 9（r=0.999 9），表明綠原酸進(jìn)樣量在0.082 5～0.825 0 μg峰面積與進(jìn)樣量線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)。按“1.2.6.3”方法進(jìn)行操作，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，測得峰面積的RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.6.4”方法進(jìn)行操作，分別制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果得出6份樣品含量的RSD為0.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.6.5”方法進(jìn)行操作，分別在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣分析并計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果得出RSD為0.3%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.6 加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.6.6”方法進(jìn)行操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），6份樣品的加樣回收率為103.28%～104.36%，平均回收率為104.0%，RSD為0.4%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 耐用性

按照“1.2.7”方法進(jìn)行操作，結(jié)果表明（表2），當(dāng)流動(dòng)相比例、柱溫、流速發(fā)生微小變化以及使用不同型號的色譜柱時(shí)，對含量測定結(jié)果無顯著影響，表明色譜條件的耐用性良好。

2.3 樣品測定

按照“1.2.8”方法操作，分別對雙葛止瀉口服液3批樣品（20170201、20170202、20170203）的含量進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這3批樣品的含量分別為0.99、0.85、0.99 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測波長的選擇

通過紫外掃描，綠原酸在328 nm處有最大吸收，因《中國獸藥典》2015年版一部[6]金銀花藥材含量測定項(xiàng)綠原酸檢測波長為327 nm，且文獻(xiàn)報(bào)道中[7-9]，綠原酸的檢測波長也多采用327 nm。綜合考慮，選擇327 nm為檢測波長。

3.2 色譜條件的考察

參考《中國獸藥典》2015年版一部金銀花藥材及相關(guān)文獻(xiàn)方法[10]，流動(dòng)相以乙腈- 0.4%磷酸溶液（13∶87）為基礎(chǔ)進(jìn)行比例調(diào)整，結(jié)果以乙腈- 0.4%磷酸溶液（11∶89）為流動(dòng)相梯度洗脫，所得色譜峰峰形較好，陰性對照無干擾。通過不同流動(dòng)相比例、柱溫、流速、pH、色譜柱的耐用性試驗(yàn)，表明該方法色譜條件的耐用性較好。

3.3 流動(dòng)相洗脫方式的選擇

為縮短樣品運(yùn)行時(shí)間，提高檢測效率，分別比較了等度洗脫與梯度洗脫2種條件下的色譜行為。等度洗脫的流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水（11∶89），梯度洗脫條件同“1.2.1 ”梯度洗脫程序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在等度洗脫條件下，采用色譜柱Aglient ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），樣品中最后一個(gè)峰保留時(shí)間為46.488 min。在梯度洗脫條件下，樣品運(yùn)行時(shí)間為25 min，流動(dòng)相的比例變化發(fā)生在主峰之后，可以將主峰之后的成分盡快沖出而縮短運(yùn)行時(shí)間，且對主峰的色譜行為沒有影響。因此確定綠原酸的含量測定采用梯度洗脫。

該研究建立了一種高效液相色譜法測定雙葛止瀉口服液中綠原酸含量的方法，該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性好，可用于該制劑中綠原酸的質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱靜，豐杰，賈毓寧.金銀花中綠原酸含量不確定度的評定[J].中成藥，2017，39（10）：2207-2209.

[2]? 夏偉，余永亮，楊紅旗，等.金銀花化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（33）：126-127，165.

[3]? 宋亞玲，王紅梅，倪付勇.金銀花中酚酸類成分及其抗炎活性研究[J].中草藥，2015，46（4）：490-495.

[4]? 路俊仙，梁瑞雪，林慧彬.金銀花抗流感病毒作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2018，32（5）：77-81.

[5]? 吳嬌，王聰，于海川.金銀花中的化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（4）：225-234.

[6]? 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典：一部[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015.

[7]? 趙增成，林樹乾，李桂明，等.清營口服液質(zhì)量檢測方法的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43（6）：1647-1653.

[8]? 劉中均，朱力陽，馮光富，等.HPLC測定紫蒲痛風(fēng)合劑中的綠原酸[J].華西藥學(xué)雜志，2016，31（6）：638-639.

[9]? 劉亭，李梅，胡賀佳，等.白茄根中綠原酸的含量測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（25）：164-167，175.

[10]? 雍燕，方炳虎，劉國昌，等.HPLC法同時(shí)測定金葉清瘟散中綠原酸和咖啡酸的含量[J].中國獸藥雜志，2014，48（9）：30-33.