陳志雄，胡志剛，王洪洋，張鶯鶯，曹建國(guó)，吳華莉，談?dòng)浪?，涂尾?

(1 原南京軍區(qū)司令部農(nóng)副業(yè)基地，江蘇 南京 210016；2 原上海警備區(qū)南匯農(nóng)副業(yè)基地，上海 200035；3 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；4 上海種豬工程技術(shù)研究中心，上海 201106)

實(shí)驗(yàn)用小型豬是我國(guó)寶貴的物種資源，也是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最廣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。由于小型豬體型小，操作方便，同時(shí)小型豬的血液生理生化指標(biāo)和人的比較接近，皮膚等器官和人的比較相似，就目前來(lái)說(shuō)小型豬應(yīng)該是人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。作為實(shí)驗(yàn)豬，小型豬的體型對(duì)實(shí)驗(yàn)操作者來(lái)說(shuō)尤為重要。在對(duì)小型豬進(jìn)行育種的時(shí)候，所采用的方法與商品豬的不一樣，并不是挑選體型大的留種。因此，研究小型豬肥胖基因?qū)τ谛⌒拓i育種非常重要。

肥胖(Obese，OB)基因在調(diào)控實(shí)驗(yàn)豬繁殖和采食等代謝方面發(fā)揮著極其重要的功能，其表達(dá)的產(chǎn)物是調(diào)控動(dòng)物機(jī)體能量平衡和脂肪細(xì)胞分泌的重要作用。豬OB基因由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，定位于18號(hào)染色體上，5’端是97 bp的先導(dǎo)序列，3’端是3.7 kb的非編碼序列。目前，OB基因一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重要研究方向，有研究表明該基因的多態(tài)性和豬的多個(gè)性狀相關(guān)，如肉質(zhì)性狀和繁殖性狀等。由于我國(guó)對(duì)實(shí)驗(yàn)用小型豬的研究起步較晚，因此有關(guān)實(shí)驗(yàn)用小型豬OB基因的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用小型豬OB基因的多態(tài)性，為實(shí)驗(yàn)用小型豬育種提供分子標(biāo)記輔助育種，積累實(shí)驗(yàn)用小型豬的基礎(chǔ)資料，更好地對(duì)實(shí)驗(yàn)用小型豬選種選育。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

本次試驗(yàn)的常用試劑：2×Taq Master Mix(Dye Plus)購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號(hào)：P112；Pvu Ⅱ和Hinf Ⅰ購(gòu)自New England Biolabs公司，貨號(hào)分別為：R0151S和R0155T；DL2000 DNA Maker購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，貨號(hào)：10501ES60；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)：DP304。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物選自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)用小型豬封閉群核心群中30頭實(shí)驗(yàn)用小型豬，年齡在2～3月。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豬耳朵組織基因組提取

試驗(yàn)時(shí)稱(chēng)取0.3 mg豬耳朵組織，將其放入組織破碎機(jī)中破碎，將破碎的組織樣品放入1.5 mL的EP管中，使用天根公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA，并將30個(gè)樣品分別標(biāo)記。

1.3.2 OB基因3 469位點(diǎn)檢測(cè)(PCR-RFLP)

設(shè)計(jì)針對(duì)OB位點(diǎn)的引物，并委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

OB-F：5’-GAG CCA ACA TCT CTC TCG CTG AG -3’

OB-R：5’-GAC TCC TGG AAG CTC AGG TTT CTT C-3

1.3.3 PCR反應(yīng)體系

按照表1配置PCR反應(yīng)體系。

94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。

1.3.4 酶切反應(yīng)體系

酶切反應(yīng)體系如表2所示。酶切溫度37 ℃，時(shí)間30 min。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

配置3%瓊脂糖凝膠，電壓120 V，時(shí)間12 min，結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示。

2.2 統(tǒng)計(jì)基因型

從酶切結(jié)果條帶分析，實(shí)驗(yàn)用小型豬OB基因的基因型如表3所示。

3 討論與分析

嚴(yán)燕等對(duì)圩豬OB基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，OB基因存在C/T、A/G、C/T和G/T這4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，群體存在A和B等位基因，表現(xiàn)3種基因型：AAABBB。Jiang等研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)分別位于867 bp、1 112 bp、3 469 bp和3 714 bp處。OB基因目前在動(dòng)物體內(nèi)有著非常廣泛的生理功能，不僅會(huì)影響動(dòng)物的許多疾病，還與非常多的經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)聯(lián)。Stephens對(duì)豬染色體研究發(fā)現(xiàn)，OB基因定位于18號(hào)染色體上，與已有研究的神經(jīng)肽Y(NeuroPeptide Y，NPY)基因表達(dá)產(chǎn)物NPY一樣，都能增強(qiáng)促黃體素(Luteinizing Hormone，LH)的釋放，對(duì)豬的繁殖性能有很大的影響。但是，在小型豬方面，和肥胖相關(guān)的OB基因鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究重點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)用小型豬的OB基因多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，在30個(gè)個(gè)體中，5個(gè)個(gè)體為AA基因型，19個(gè)個(gè)體為AB基因型，6個(gè)個(gè)體為BB基因型。檢測(cè)主要是為了填補(bǔ)實(shí)驗(yàn)用小型豬基礎(chǔ)資料，并為小型豬選育選種提供分子標(biāo)記輔助育種。由于實(shí)驗(yàn)用小型豬封閉群數(shù)量有限，需要等封閉群數(shù)量擴(kuò)大，下一步對(duì)群體進(jìn)行OB基因檢測(cè)，對(duì)基因型頻率進(jìn)行檢測(cè)，更進(jìn)一步的掌握實(shí)驗(yàn)用小型豬的OB基因型，為小型豬選育更適合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供有力支撐。