王永盛 王蘋莉 程一升 趙元琛

（浙江省溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

腦梗死是由腦血管阻塞引起的嚴重腦缺血缺氧性組織壞死疾?。?］。各種疾病和不良生活習(xí)慣可能導(dǎo)致腦梗死，如高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、血脂異常等，被證實與本病的高死亡率和致殘率呈正相關(guān)［2］。目前，對腦梗死的治療主要是溶栓和血栓清除，但治療效果不太理想［3］。因此，尋找有效的策略，以提高其腦梗死的治療效果成為研究的熱點。頭針電刺激是一種非藥物治療，可能對神經(jīng)功能的恢復(fù)有促進作用［4］。一項薈萃分析表明頭針電刺激對腦梗死治療有積極作用，有助于腦梗死患者的綜合康復(fù)［5］。神經(jīng)元細胞的加速凋亡是腦梗死的一個重要因素，其可能是由凋亡相關(guān)因素的調(diào)節(jié)引起的，如Caspase家族和B細胞淋巴瘤2（Bcl-2）家族［6］。 動物研究表明，頭針電刺激可以通過抑制缺血腦的凋亡，對腦組織發(fā)揮保護作用［7］。雖然頭針電刺激對腦損傷具有抗凋亡和神經(jīng)保護作用，但其抗凋亡作用機制尚不清楚。因此，本研究旨在觀察頭針電刺激對急性腦梗死大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和和Caspase-3表達的影響及神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡情況，為頭針電刺激治療腦梗死提供潛在的治療策略?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠45只，體質(zhì)量220～260 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SYXK（黑）2016-0009。

1.2 儀器與試劑 1）主要儀器：激光多普勒血流檢測儀（PE-5001，Sweden）購自上海永州實驗設(shè)備有限公司；光學(xué)生物學(xué)顯微鏡購自日本Nikon公司；臺式冷凍離心機Sorvall STR ATOS購自德國Heraeus公司；激光多普勒血流檢測儀（PE-5001，Sweden）購自上海永州實驗設(shè)備有限公司；凝膠成像儀購自美國UVP公司；BIO-RAD垂直電泳儀購自美國BIO-RAD公司；病理切片機、包埋機、脫水機購自德國Leica公司。2）主要試劑：三苯基四氮唑（TTC）購自美國Biosharp公司；水合氯醛購自上海上藥新亞藥業(yè)有限公司；蛋白抽提試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗Bax、Bcl-2和Caspase-3單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司；鼠抗GADPH單克隆抗體和辣根過氧化物酶HRP標記山羊抗鼠IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司 ；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 分組與造模 實驗前將大鼠置于SPF級環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗，動物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。用隨機數(shù)字表法將SD大鼠均分為3組：假手術(shù)組、模型組和頭針電刺激組，假手術(shù)組15只，其余根據(jù)造模后再分，每組15只。每組用5只大鼠進行神經(jīng)運動功能評分和TTC染色、5只進行血腦屏障通透性檢測、5只進行mRNA水平檢測。大鼠腦缺血再灌注損傷模型制備：采用線栓法制備動物大腦中動脈栓塞模型。大鼠禁食12 h后用10%水合氯醛（35 mg/kg）腹腔麻醉后，將大鼠仰臥于手術(shù)臺上，沿頸正中線行手術(shù)切口，充分暴露左側(cè)血管，分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，用激光多普勒血流檢測儀檢測左側(cè)大腦血流變化，待血流趨于平穩(wěn)時，結(jié)扎頸外動脈遠端后，在頸外動脈上切開一個小切口，將一條尼龍線（直徑0.25 mm，尖端涂抹硅膠）插入頸內(nèi)動脈約20 mm，并結(jié)扎，阻塞大腦血流。用生理鹽水清洗切口后逐層縫合。術(shù)后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續(xù)使用3 d。假手術(shù)組只切開皮膚和分離血管，不進行阻塞血流。剔除5只造模不成功大鼠。

1.4 干預(yù)方法 頭針電刺激組在造模成功后24 h根據(jù)《大鼠穴位圖譜》進行電針治療，大鼠仰臥于針刺臺上，用28號毫針刺激百會穴和大椎穴，進針2 mm后快速捻轉(zhuǎn)1 min后，接頻率1 Hz的脈沖電療儀，刺激時長每日1次，每次30 min，持續(xù)14 d。假手術(shù)組和模型組每天固定于針刺臺上30 min，不進行頭針電刺激，療程同頭針電刺激組。

1.5 標本采集與檢測 1）神經(jīng)功能評分。根據(jù)Bederson′s 評分標準進行評分［8］，采用雙盲法，于造模后14 d后評價。2）TTC染色。做完功能評分的大鼠進行處死，取完整腦組織，行冠狀位切片，厚度2 mm，置于2%的TTC染液中孵育30 min，用磷酸鹽緩沖液終止染色。用Image Pro Plus 6.0軟件計算梗死體積。3）Western Blotting法檢測Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達。實驗結(jié)束后，處死大鼠，取適量右側(cè)腦組織，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌2次，按1∶9加入蛋白抽提試劑，用超聲進行破碎，裂解15 min后離心后取上清，進行蛋白含量測定后調(diào)整蛋白濃度至一樣，加入1/5體積的5×Buffer進行變性，-80℃保存。進行電泳、孵育一抗、孵育二抗，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并進行分析。4）TUNEL法檢測細胞凋亡。腦組織進行常規(guī)石蠟脫水、包埋、切片（2.0 μm），二甲苯脫蠟（2 次）、無水乙醇脫水 （2次）、95%和75%乙醇各洗一次，按TUNEL法檢測細胞凋亡說明書進行細胞凋亡檢測。使用熒光顯微鏡檢測凋亡細胞（綠色熒光染色），計數(shù)陽性細胞率。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦梗死體積的比較 見表1，圖1。假手術(shù)組未見梗死灶，其余各組均出現(xiàn)不同程度梗死；與模型組相比，頭針電刺激組梗死體積明顯減?。≒＜0.05）。

表1 各組大鼠腦梗死體積的比較（%，±s）

表1 各組大鼠腦梗死體積的比較（%，±s）

與模型組比較，*P＜0.05。下同

組 別 n 大鼠腦梗死體積假手術(shù)組 5模型組 5 0 25.13±5.06頭針電刺激組 5 13.85±3.64*

圖1 各種大鼠腦梗死體積（TTC染色）

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能Bederson′s評分比較 見表2。假手術(shù)組大鼠表現(xiàn)正常；模型組出現(xiàn)不同程度的癱瘓側(cè)前肢回收屈曲腹下、病灶對側(cè)偏癱、爬行時向右劃圈和癱瘓后肢向后外展；給予頭針電刺激后，大鼠神經(jīng)功能 Bederson′s評分降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能Bederson′s評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能Bederson′s評分比較（分，±s）

組 別 n Bederson′s評分假手術(shù)組 5模型組 5 0 3.02±0.41頭針電刺激組 5 2.13±0.24*

2.3 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比較 見表3，圖2。與假手術(shù)組相比，模型組和頭針電刺激組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3蛋白表達量均增加，Bcl-2蛋白表達量均降低（P＜0.05）；與模型組相比，頭針電刺激組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3蛋白表達量降低，Bcl-2蛋白表達量增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平比較（±s）

與假手術(shù)組比較，△P＜0.05。下同

組 別 Bcl-2 Caspase-3假手術(shù)組 2.25±0.46 0.48±0.04 n Bax 5 0.30±0.03模型組 0.61±0.08△ 1.54±0.23△5 1.93±0.39△頭針電刺激組 5 0.86±0.27*△ 0.98±0.07*△ 0.88±0.24*△

圖2 各組大鼠腦組織中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白水平的比較

2.4 各組大鼠腦組織中細胞凋亡率的比較 見表4，圖3。與假手術(shù)組相比，模型組和頭針電刺激組細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與模型組相比，頭針電刺激組細胞凋亡率降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腦組織中細胞凋亡率比較（%，±s）

表4 各組大鼠腦組織中細胞凋亡率比較（%，±s）

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圖3 TUNEL染色結(jié)果（200倍）

3 討 論

頭針電刺激已被廣泛用于治療中風患者，能提高智力和記憶力，并刺激意識，改善患者認知功能［9］。一項對隨機對照試驗的系統(tǒng)綜述表明，頭針電刺激對腦血管性認知障礙患者的認知功能有積極作用［10］。同時，也有研究證實，頭針電刺激可以抑制細胞凋亡［11］。本研究結(jié)果表明，頭針電刺激能改善急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能，同時抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡。本研究支持了頭針電刺激通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達來保護神經(jīng)功能的觀點。

本研究的模型組神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡增加，提示細胞凋亡與缺血后的神經(jīng)元損傷有關(guān)。同時，用頭針電刺激干預(yù)后，神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡數(shù)量明顯減少，說明頭針電刺激具有抗凋亡作用。然而，這種抗凋亡作用的機制尚不清楚。已知Bcl-2家族參與細胞凋亡調(diào)控，它由多種參與細胞凋亡調(diào)控的因子組成，如促凋亡因子Bax和Bak，以及Bcl-2和Bcl-xL等凋亡抑制因子，抗凋亡和促凋亡因子具有協(xié)同作用［12-13］。最近的研究表明，Bcl-2家族的調(diào)控受損進一步加重了缺血神經(jīng)元的損傷，Bax和Bcl-2在腦組織中的平衡被打破［14］。電針能促進Bcl-2表達，同時抑制Bax的表達，使Bcl-2與Bax的比值增加，從而控制細胞凋亡，保護神經(jīng)元不受損傷［15］。我們的結(jié)果與上述研究相一致。同時，Caspase家族在細胞凋亡過程中也發(fā)揮了重要作用，Caspase-3是公認的促進細胞凋亡的指標，其被激活，表示細胞進入不可逆階段［16］。本研究也證實了這一觀點。當然還有其他的因子也參與了細胞凋亡的發(fā)生，如STAT3，STAT3被磷酸化激活，從而抑制細胞凋亡，對其激活的抑制是腫瘤的潛在治療目標，如肝癌［17］。同時，STAT3激活可以促進Bcl家族中凋亡抑制因子的表達，有助于增強細胞的存活，其結(jié)果在鱗狀細胞癌中也得到證實［18］。 多種細胞因子（IL-6、TNF-α 等）也參與了細胞凋亡的調(diào)節(jié)，這些細胞因子在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。腦梗死后都會出現(xiàn)不同程度的炎癥，這也證明這些細胞因子表達增加，使MAPK信號通路被激活，調(diào)控Bcl-2家族成員的表達，最終誘導(dǎo)了細胞凋亡［19］。由于本研究的限制，我們并沒有檢測STAT3、細胞因子、MAPK等的水平，只進行了凋亡相關(guān)蛋白的檢測。因此，我們推斷，頭針電刺激能激活Bcl-2，抑制Bax的表達，這可能是其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的潛在原因。同時，我們也必須注意一個問題，本研究使用的成年雄性大鼠，而老年人更容易發(fā)生腦梗死，而衰老的特征是大量的神經(jīng)和生理改變。因此，頭針電刺激的實驗結(jié)果可能因年齡和/或性別而異，進一步的實驗和臨床試驗應(yīng)該考慮到這一點。

綜上所述，頭針電刺激能改善急性腦梗死大鼠的神經(jīng)功能，其機制可能與下調(diào)Bax和Caspase-3蛋白表達，上調(diào)Bcl-2蛋白表達，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞凋亡有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為頭針電刺激在急性腦梗死治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但頭針電刺激對腦梗死患者神經(jīng)保護作用的相關(guān)分子機制尚須進一步探索。