黃力鵬 吳春迎 高宏梁 陳芒芒△

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)定理臨床學(xué)院，浙江 溫州 325000；2.浙江省湖州市中心醫(yī)院，浙江 湖州313000）

當(dāng)關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性變性和繼發(fā)性增生，導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動功能障礙，約有12%的患者發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎［1-2］。由于外傷和交通事故的增加，創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率有增加的趨勢。目前，軟骨損傷后的疾病發(fā)展過程還不清楚，但多種炎性因子 ［白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］和氧自由基等與創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［3］。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）信號通路是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中重要的通路，可調(diào)控下游的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［4-5］。龍膽苦苷（GPS）屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類，是龍膽科龍膽屬植物龍膽的有效成分之一，具有抗炎解熱、增強(qiáng)免疫、抗病原體等作用［6］。但龍膽苦苷在創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎是否具有保護(hù)作用報道較少。因此，本研究通過探討龍膽苦苷通過NF-κB信號通路對創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用機(jī)制研究，為龍膽苦苷治療創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制及療效研究提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量220～240 g，在溫度為 18～24℃、濕度為 40%～70%的環(huán)境中自由進(jìn)食，控制飼養(yǎng)環(huán)境晝夜循環(huán)（12 h/12 h），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK（魯）2016-0013。

1.2 試劑與儀器 龍膽苦苷（純度≥98%）購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；戊巴比妥鈉購自上海上藥新亞藥業(yè)有限公司；鼠抗NF-κB和NF-κB抑制蛋白（I-κB）抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶HRP標(biāo)記親和純化山羊抗鼠IgG二抗、鼠抗GADPH單克隆抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)購自日本奧林巴斯公司；HBS-1096B酶標(biāo)儀購自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自碧云天生物科技有限公司BIO-RAD垂直電泳儀購自美國BD公司；凝膠成像儀購自美國UVP公司；ECL顯影液購自美國Millipore公司；組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)等病理配套設(shè)備購自德國Leica公司。

1.3 分組與造模 將實(shí)驗(yàn)大鼠平均分為3組：對照組、模型組和龍膽苦苷治療組。使用HuIth模型制作大鼠創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎模型［7］。用戊巴比妥鈉（300 mg/kg）腹腔麻醉后使大鼠仰臥于手術(shù)臺上，對右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)進(jìn)行剃毛和消毒，于髕骨外側(cè)縱切長約2 cm的切口暴露膝關(guān)節(jié)，模型組和龍膽苦苷治療組大鼠剪斷韌帶后完整切除內(nèi)側(cè)半月板，對照組大鼠只切開關(guān)節(jié)腔不破壞韌帶和半月板，用生理鹽水清洗切口后逐層縫合切口。術(shù)后給予20萬U青霉素肌肉注射，連續(xù)使用3 d。不固定肢體，在造模后第7日驅(qū)趕動物，每日2次，30 min/次，連續(xù) 4周。

1.4 干預(yù)方法 在造模后1周開始給予藥物，龍膽苦苷治療組大鼠灌胃給予50 mg/kg龍膽苦苷溶液，對照組和模型組給予等量蒸餾水，每日1次，連續(xù)8周，在最后1次給藥后1 h處死大鼠，取病變部位關(guān)節(jié)，每組取5只大鼠收集軟骨組織，-80℃保存?zhèn)溆?，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測；其余5只膝關(guān)節(jié)進(jìn)行甲醛固定后進(jìn)行病理學(xué)檢測。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 病理標(biāo)本的制作和Mankin評分：對膝關(guān)節(jié)進(jìn)行固定、脫鈣、脫水、包埋、切片、HE染片后封片進(jìn)行觀察膝關(guān)節(jié)病理改變情況。根據(jù)Mankin法對骨關(guān)節(jié)炎組織進(jìn)行評分。酶聯(lián)吸附法（ELISA）：檢測軟骨組織中NO和TNF-α含量。取出適量軟骨組織，進(jìn)行研碎后將相應(yīng)一抗稀釋至10 μg/mL，加入96孔板中，0.1 mL/孔，4℃過夜，洗滌3次，加血清0.1 mL于上述反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h；加入相對應(yīng)的二抗0.1 mL，孵育 1 h；加入底物溶液0.1 mL，顯色20 min；加入2 mol/L硫酸0.05 mL終止反應(yīng)，于450 nm處測各孔吸光度（A）值。Western blotting法檢測軟骨組織中NF-κB和I-κB蛋白水平：取出適量軟骨組織，據(jù)組織量加入胞蛋白抽提試液，冰浴2 h；4℃離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白定量；調(diào)整蛋白濃度致同一濃度，加入1/5體積的5×Buffer，沸水進(jìn)行變性，進(jìn)行電泳、切膠；孵育一抗、4℃過夜、孵育相對于二抗，采集圖像，用凝膠成像儀對免疫印跡條帶灰度值并進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用IBM SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（±s）表示，分析前進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析進(jìn)行判斷，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)觀察 見圖1。對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊呈柱狀，染色質(zhì)分布均勻；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨層變薄、表面不光滑，結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞排列紊亂，有壞死和凋亡的細(xì)胞；龍膽苦苷治療組膝關(guān)節(jié)軟骨組織在變性、壞死方面均較模型組輕。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)比較（HE染色，400倍）

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分比較 見表1。與對照組比較，模型組和龍膽苦苷治療組Mankin評分增加（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷治療組Mankin評分降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分比較（分，±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n Mankin評分對照組 5模型組 5 0.42±0.03 6.24±1.32*龍膽苦苷治療組 5 3.41±0.90*△

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NO和TNF-α含量比較 見表2。與對照組比較，模型組和龍膽苦苷治療組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NO和TNF-α含量增加（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷治療組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NO和TNF-α含量降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NO和TNF-α含量比較（±s）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NO和TNF-α含量比較（±s）

組 別 n NO（μg/L） TNF-α（ng/L）對照組 5模型組 5 18.42±2.57 92.46±13.72 62.73±9.08* 184.42±25.49*龍膽苦苷治療組 5 31.68±5.81*△ 135.60±21.91*△

2.4 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB和I-κB蛋白水平比較 見表3，圖2。與對照組比較，模型組和龍膽苦苷治療組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB蛋白水平增加，I-κB 蛋白水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，龍膽苦苷治療組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB蛋白水平降低，I-κB 蛋白水平增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB和I-κB蛋白水平比較（±s）

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB和I-κB蛋白水平比較（±s）

組 別 n NF-κB I-κB對照組 5模型組 5 0.20±0.03 0.76±0.10 0.76±0.11* 0.22±0.05*龍膽苦苷治療組 5 0.34±0.04*△ 0.51±0.13*△

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κB和I-κB蛋白電泳條帶

3 討 論

創(chuàng)傷性骨性關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)學(xué)屬于“痹證”中的“骨痹”范疇，以“風(fēng)寒濕痹阻”和“氣滯血瘀”多見，病機(jī)為風(fēng)寒濕邪入侵經(jīng)絡(luò)有關(guān)，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)阻滯，形成骨性關(guān)節(jié)炎［8］。目前對骨性關(guān)節(jié)炎的治療尚缺乏有效的治療手段，尤其是早期治療，最終只能通過關(guān)節(jié)置換來緩解病痛和改善功能。而從發(fā)病到關(guān)節(jié)置換是一個漫長過程，這期間給患者在精神和經(jīng)濟(jì)上帶來一定的壓力。發(fā)揮中醫(yī)學(xué)的優(yōu)勢，通過中醫(yī)理論尋找相應(yīng)的治療藥物成為治療骨性關(guān)節(jié)炎乃至更多疾病的突破口。龍膽苦苷是龍膽的主要有效成分，龍膽具有“活血舒筋、祛風(fēng)除濕”功能，多配伍治療關(guān)節(jié)疼痛［9］。但目前龍膽苦苷對骨性關(guān)節(jié)炎的治療機(jī)制還不清楚。由于倫理學(xué)的限制，需要制作創(chuàng)傷性骨性關(guān)節(jié)炎的動物模型。Hulth模型是作用膝關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典動物模型，借助手術(shù)使關(guān)節(jié)不穩(wěn)定而誘發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎，此方法特別適用于軟骨病理改變的研究。本研究通過病理及大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分顯示，大鼠創(chuàng)傷性骨性關(guān)節(jié)炎成功模型造模成功。

關(guān)節(jié)炎大多伴隨著明顯的紅、腫、熱、痛、功能受限，提示炎癥在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要作用，IL-1β、IL-6、NO 及 TNF-α 等炎癥因子與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（TBI）急性期密切相關(guān)［10-12］。 TNF-α 和 NO 是炎癥反應(yīng)的兩個關(guān)鍵細(xì)胞因子［13］。TNF-α是炎癥后最早出現(xiàn)的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)他們過度表達(dá)時介導(dǎo)炎癥因子趨化作用而加劇瀑布樣炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損傷［14］。研究發(fā)現(xiàn)，通過減少或拮抗TNF-α的產(chǎn)生可以改善急性肺損傷大鼠的生存狀況［15］。在炎癥發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后大量表達(dá)NO，大量表達(dá)的NO又加劇了瀑布樣炎癥反應(yīng)［16］。本研究結(jié)果顯示，模型組軟骨組織中TNF-α和NO水平明顯增高，在給予龍膽苦苷后都有不同程度的下降，說明龍膽苦苷在一定程度上抑制了炎癥因子的表達(dá)。

探討龍膽苦苷抗炎的作用機(jī)制，為其藥理作用的開發(fā)具有積極的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號通路與炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［17］。細(xì)胞膜上的Toll樣受體4（TLR-4）能夠特異性識別炎癥信號，通過TLR-4跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF-κB信號通路，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)［18］。NF-κB是炎癥、應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)器，當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時，滯留于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)NF-κB在接受了轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）的信號后，很快進(jìn)入細(xì)胞核，與基因中的κB位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，啟動細(xì)胞凋亡等引起細(xì)胞損傷［19］。I-κB能與NF-κB結(jié)合形成非活性的二聚體，抑制了NF-κB在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的穿梭，同時在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮作用［20］。本研究結(jié)果顯示，模型組軟骨組織中NF-κB明顯增高，在給予龍膽苦苷后I-κB表達(dá)增加，NF-κB合成受到抑制，說明NF-κB信號通路被抑制。

綜上所述，龍膽苦苷能夠改善創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)、降低軟骨組織中NO和TNF-α含量，其機(jī)制可能與降低了NF-κB蛋白水平，抑制NF-κB信號通路，為龍膽苦苷的藥用價值的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。