于長生 宮麗鴻 肖福龍

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

動脈粥樣硬化是引起心腦血管病的重要病理基礎(chǔ)，主要表為血管壁出現(xiàn)粥樣物質(zhì)，導(dǎo)致血管腔不同程度狹窄，最終引起血管堵塞，出現(xiàn)供血障礙。近年來動脈粥樣硬化的發(fā)病率及致死率逐年上升［1］。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制可以從不同角度進行闡述［2］。研究表明動脈粥樣硬化的獨立危險因素之一是凋亡［3］，斑塊內(nèi)細(xì)胞的凋亡不利于斑塊穩(wěn)定。細(xì)胞凋亡參與了動脈粥樣硬化的發(fā)病過程。Caspases屬于半胱氨酸蛋白酶， 其對于凋亡有重要的促進作用［4］。 前期研究［5-7］證明搜風(fēng)祛痰中藥復(fù)方穩(wěn)斑湯具有抗動脈粥樣硬化及穩(wěn)定斑塊作用，因此本文在前期基礎(chǔ)上從凋亡角度觀察穩(wěn)斑湯對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達的影響，以便于探討穩(wěn)斑湯抗動脈粥樣硬化的作用機制，豐富穩(wěn)斑湯的臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物6～8周ApoE基因敲除小鼠70只，正常 C57BL/6J小鼠12只，由北京大學(xué)實驗動物中心美國Jackson實驗室成功引進并培育，實驗動物合格證號：SCXK （京）2013-0001。SPF級，體質(zhì)量（19.0±1.0）g，雌雄各半。用含1.5%膽固醇的高脂飼料（經(jīng)60Coγ滅菌照射處理，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室提供）飼養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠，正常小鼠給普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為2級，室溫保持在22～24℃，相對濕度 50%，光照時間 7∶00～19∶00，自由飲食水。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。穩(wěn)斑湯組方：地龍15 g，全蝎 5 g，水蛭 15 g，蜈蚣 1 條，陳皮 15 g，白術(shù) 15 g，半夏15 g。將上述中藥加工，并制成含生藥2 g/mL的中藥濃縮液，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥局生產(chǎn)；阿托伐他汀鈣片10 mg/片（輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號J20030047）。蘇木精染液、伊紅染液（北京博奧森生物科技有限公司）；兩步法RT-PCR試劑盒（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號AT401-D1）；DNA maker（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號BM121-01）；Trizol（購自 invitrogen 公司，批號 15596-026）；引物（北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司代為合成）。2）儀器：300型脫水機，EG1150型石蠟包埋機，RM2235型切片機均為德國Leica公司產(chǎn)品；BX41型數(shù)碼顯微鏡，CHA型光學(xué)顯微鏡均為Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 模型制備 13周后，隨機處死4只，取腹主動脈根部，HE染色觀察動脈粥樣硬化程度，確定模型制造成功。

1.4 分組與給藥 造模成功的ApoE基因敲除小鼠66只，隨機選取60只分為模型組，穩(wěn)斑湯低、中、高劑量組及他汀組，每組12只。繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)，根據(jù)成人每日臨床推薦的常用劑量，按成人與小鼠的體表面積折算系數(shù)0.0026折算成小鼠用量。模型組給予生理鹽水0.3 mL/d，穩(wěn)斑湯低、中、高劑量組分別給予穩(wěn)斑湯 6.175、12.35、24.7 g/（kg·d），他汀組給予阿托伐他汀 27.3 mg/（kg·d）。 各組每日灌胃給藥 1次。 正常C57BL/6J小鼠12只設(shè)為空白對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)，生理鹽水0.3 mL/d灌胃。各組均給藥7 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 末次給藥當(dāng)日夜晚禁食，第2天取材。每組分別隨機選取10只小鼠，禁食并經(jīng)眼眶靜脈叢取血，將血清離心，并凍存于-80℃。脫頸處死小鼠，解剖并取心臟及主動脈，利用10%甲醛固定心臟，凍存管內(nèi)保存主動脈。1）主動脈組織病理學(xué)觀察：于主動脈根部取出4個相同切面，0.9%氯化鈉溶液沖洗，固定，乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，6 μm厚度進行切片。繼而進行蘇木精-伊紅染色，樹膠封片。光鏡下觀察其組織形態(tài)。2）Caspase-3 mRNA檢測：采用RT-PCR法檢測各組小鼠動脈組織中Caspase-3 mRNA的表達。Trizol抽提法提取動脈組織中總RNA，測定濃度及質(zhì)量后，采用一步法RT-PCR試劑盒，以β-actin為內(nèi)參，對Caspase-3相應(yīng)引物進行擴增（引物序列：上游引物：5′-CTGGACTGCGGTATTG AG-3′， 下游引物：5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGC-3′，102 bp）。PCR 反應(yīng)體系：cDNA 3 μL，10 mmol/LdNTP 2.5 μL，25 mmol/L Mg2+5 μL，10×PCR Buffer 5μL，DEPC H2O 31 μL，Taq 酶 0.5 μL，Caspase-3、β-action 引物各 1.5 μL。 94℃變性 1 min，58℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，循環(huán)35次。擴增產(chǎn)物與1.5%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)中采集圖像，并測定目的基因和內(nèi)參基因擴增條帶的積分光密度值，并以目的基因積分光密度值/內(nèi)參基因積分光密度值的比值作為該例樣本目的基因的相對表達水平，進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠主動脈形態(tài)學(xué)改變的比較 見圖1?？瞻捉M：小鼠主動脈內(nèi)膜表面光滑未見異常。模型組：動脈管壁破損，并有明顯的粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，斑塊內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞，偶有一些炎性細(xì)胞。穩(wěn)斑湯組、他汀組：主動脈內(nèi)膜均有不同程度的斑塊，但其面積均小于模型組。

圖1 各組小鼠腹主動脈病理情況（HE染色，100倍）

2.2 各組小鼠主動脈組織中Caspase-3的mRNA表達水平的比較 見表1、圖2。與空白對照組比較，模型組Caspase-3 mRNA含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，穩(wěn)斑湯中、高劑量組Caspase-3 mRNA含量均降低（P＜0.05）。與他汀組比較，穩(wěn)斑湯中、高劑量組Caspase-3 mRNA含量無明顯差異（P＞0.05）。

3 討 論

古代中醫(yī)并沒有動脈粥樣硬化病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸屬于胸痹心痛等疾病?；颊叨嗍掣嗔缓裎?，以致脾傷虛而生痰，痰瘀互結(jié)以致內(nèi)癰毒熱生風(fēng)。風(fēng)邪特點為善行而數(shù)變，風(fēng)痰內(nèi)動，相似于動脈粥樣硬化斑塊的破裂。正如《醫(yī)方考》言“風(fēng)痰者，濕土生痰，痰生熱，熱生風(fēng)也”，故宮麗鴻教授創(chuàng)新性提出風(fēng)痰理論并創(chuàng)以穩(wěn)斑湯治療此病，方藥中蜈蚣具有息風(fēng)、止痙、通絡(luò)功效；全蝎具有息風(fēng)、通絡(luò)、散結(jié)功效；地龍具有息風(fēng)、平喘、通絡(luò)功效，3藥合用共為君藥。而白術(shù)、陳皮、半夏具有寬胸理氣、燥濕化痰作用，為臣藥；水蛭具有破血逐瘀、通經(jīng)作用，用為佐藥，上述7味藥物發(fā)揮搜風(fēng)祛痰、祛瘀通絡(luò)作用。

表1 各組小鼠主動脈組織中Caspase-3mRNA表達水平（±s）

表1 各組小鼠主動脈組織中Caspase-3mRNA表達水平（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與空白對照組比較，△P＜0.05

組 別 n空白對照組 10模型組 10他汀組 10 Caspase-3 mRNA 0.194±0.023 0.497±0.029△0.266±0.043*穩(wěn)斑湯低劑量組 10 0.448±0.114△穩(wěn)斑湯中劑量組 10 0.324±0.042*△穩(wěn)斑湯高劑量組 10 0.257±0.038*

圖2 各組主動脈組織Caspase-3 mRNA表達電泳圖

動脈粥樣硬化嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量，其危險因素包括高齡、高血糖、同型半胱氨酸、吸煙等。不穩(wěn)定斑塊的破裂可致嚴(yán)重心血管事件發(fā)生，威脅患者生存［8］。動脈內(nèi)膜有不穩(wěn)定斑塊形成是動脈粥樣硬化的特征性表現(xiàn)。動脈粥樣硬化的病理生理機制多種多樣［9-10］，目前研究認(rèn)為與脂質(zhì)損傷、炎癥損害、氧化損傷、免疫功能障礙等因素相關(guān)。

細(xì)胞凋亡屬于細(xì)胞程序性死亡［11］，并且是細(xì)胞主動死亡。細(xì)胞凋亡的特征主要是細(xì)胞膨脹繼而出現(xiàn)皺縮，染色質(zhì)凝聚成新月狀，細(xì)胞膜內(nèi)陷，進而導(dǎo)致細(xì)胞破裂，凋亡小體形成，被巨噬細(xì)胞消化［12］。很多刺激均可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞受到刺激作用，產(chǎn)生正向的細(xì)胞信號，通過線粒體啟動細(xì)胞凋亡［13］。心血管疾病的發(fā)病過程中由細(xì)胞凋亡的參與，如動脈粥樣硬化。因此，減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生對于治療和預(yù)防AS具有至關(guān)重要作用。細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)通路主要包括死亡受體通路和細(xì)胞應(yīng)激途徑，Caspase-3的激活與他們密切相關(guān)［14］，因此Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，線粒體在此中具有關(guān)鍵作用［15］。研究表明線粒體的損傷與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［16］。線粒體受到損傷后釋放CytC到胞質(zhì)，激活Caspase-3，進而被分為兩部分從而誘導(dǎo)凋亡［17］。有研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)Bcl-2的表達，調(diào)節(jié)Caspase活性，減少CytC的釋放，從而抑制oxLDL導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞凋亡［18］。吳限等［19］研究結(jié)果表明心腦通絡(luò)液能降低Caspase-3的表達，上調(diào)Bcl-2的表達，從而延緩動脈粥樣硬化的進展起到抗動脈粥樣硬化的作用。 徐欣華等［20］研究表明 Caspase-3、MMP2 表達水平與斑塊的不穩(wěn)定具有相關(guān)性。

阿托伐他汀鈣片屬于他汀類藥物，是人工合成的3-羥基-3-甲基-輔酶A還原酶的競爭性抑制劑［21］，具有穩(wěn)定斑塊，改善血管內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化應(yīng)激作用以及抑制血栓的形成等作用，因此阿托伐他汀鈣片是臨床常用的調(diào)節(jié)血脂，穩(wěn)定動脈硬化斑塊，預(yù)防動脈粥樣硬化的首選藥物［22］。故本實驗選擇阿托伐他汀鈣片作為西藥對照藥。

本研究采用高脂飼料飼養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠成功建立動脈粥樣硬化模型，其主要表現(xiàn)為形態(tài)學(xué)改變，管腔內(nèi)可見顯著的粥樣硬化斑塊出現(xiàn)，斑塊內(nèi)可有大量泡沫細(xì)胞形成等。與模型組比較，穩(wěn)斑湯各劑量組的小鼠相關(guān)血管病變程度輕、管腔面積增加，說明具有搜風(fēng)祛痰功能的穩(wěn)斑湯具有抗動脈粥樣硬化形成的作用。

本研究顯示，與空白對照組比較，模型組Caspase-3 mRNA表達水平升高，表明動脈粥樣硬化發(fā)生時，可引起Caspase-3 mRNA表達水平的升高，而穩(wěn)斑湯中、高劑量組與他汀組均能不同程度地降低Caspase-3 mRNA表達水平，這說明抑制凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達，可以有效抑制動脈粥樣硬化，穩(wěn)定動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊。與他汀組比較，穩(wěn)斑湯中、高劑量組的Caspase-3 mRNA表達無明顯差異，說明穩(wěn)斑湯中、高劑量組同阿托伐他汀片在抑制凋亡方面作用相當(dāng)。綜上所述，穩(wěn)斑湯可能通過下調(diào)ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊凋亡相關(guān)基因Caspase-3的表達來干預(yù)動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的形成及破裂。