孔令博 李艷鵬 王冬梅 姚新穎 王輝軍 楊雪冬劉佳瑩 田 莉 孟昭莉 韓 強(qiáng) 劉清泉

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院新華醫(yī)院，北京 101149；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010）

近年來(lái)，隨著超廣譜抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用，對(duì)β-內(nèi)酰胺酶類和碳青霉烯類抗生素耐藥的多重耐藥菌株和泛耐藥菌株的檢出率不斷增高［1］。耐藥菌株對(duì)人類健康的威脅及其所導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)成本急劇攀升［2］。以銅綠假單胞菌為例，據(jù)2015年至2017年中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)（CHINET）數(shù)據(jù)顯示，銅綠假單胞菌中泛耐藥株的檢出率呈上升趨勢(shì)，對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥形勢(shì)尤為堪憂［3-5］。由于銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，臨床治療非常棘手［6-8］?；谥兴帍?fù)方具有多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，前期研究以多重耐藥銅綠假單胞菌為研究對(duì)象，切合耐藥菌感染 “正虛邪侵，熱毒內(nèi)伏”的中醫(yī)病機(jī)特點(diǎn)創(chuàng)制了芪歸銀方，并證實(shí)了芪歸銀方對(duì)機(jī)體淋巴細(xì)胞增殖的干預(yù)作用［9-11］。有鑒于此，本實(shí)驗(yàn)利用多肽陣列技術(shù)從蛋白質(zhì)組學(xué)水平對(duì)芪歸銀方調(diào)控多重耐藥銅綠假單胞菌感染大鼠免疫功能的作用機(jī)制開(kāi)展了進(jìn)一步探索?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物 芪歸銀方（黃芪60 g，金銀花15 g，當(dāng)歸15 g，青蒿 10 g，虎杖 10 g）提取物（1.0 g/mL），由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥研究室提供；注射用頭孢他啶，由深圳致君制藥有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)E20100102。按照70 kg成人用量的6.3倍計(jì)算大鼠的給藥劑量。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠36只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（軍）2007-004。正常光照條件下，食、水可自由攝取，室溫控制在18～22℃之間。

1.3 菌株 多重耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株1643號(hào)，由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院細(xì)菌室提供。

1.4 試劑與儀器 M-H瓊脂平板購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司（批號(hào)：XWO1100301），立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（ASTELL公司，型號(hào)：AMA440N），恒溫培養(yǎng)箱（SAMYO 公司，型號(hào)：SIM-F124），渦混合器 （Scientific Industries公司， 型號(hào)：VORTEX-GENIE 2），低溫高速離心機(jī)（上海愛(ài)丁堡生物科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：Kendro Labofuge 400R），微量天平（METTLER公司，型號(hào)：AE100），酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)：DNM-9602），AutoSpot peptide synthesizer多肽合成儀（CEM 公司，型號(hào)：Liberty Lite），數(shù)字成像分析儀 （華瑞同康生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：FX-7）。

1.5 菌懸液制備 將實(shí)驗(yàn)菌株接種于M-H瓊脂培養(yǎng)基活化，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后，用生理鹽水洗脫菌落，3 000 r/min離心20 min，棄去上清，加入生理鹽水，混勻后吸出0.5 mL加入新的無(wú)菌試管中，加入適量生理鹽水，與比濁計(jì)進(jìn)行比濁，將菌液稀釋成24×108CFU/mL，用酶標(biāo)儀檢測(cè) OD 值為（0.675±0.005），再將其稀釋成0.48×108CFU/mL，作為實(shí)驗(yàn)菌懸液。

1.6 模型制備 SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周，室溫控制在18～22℃之間，自由獲取食、水，采血前禁食過(guò)夜。按照楊鈞等報(bào)道的方法建立多重耐藥銅綠假單胞菌腹腔感染大鼠模型［12］。具體方法如下：將多重耐藥銅綠假單胞菌菌液（以下簡(jiǎn)稱菌液）同2.0%西黃芪膠1∶1混合后，腹腔注射。注射后自由進(jìn)食、飲水。

1.7 分組與給藥 雄性SD大鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、芪歸銀方組，共3組，每組各12只。模型組腹腔注射菌液后（5 mL/kg），即給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，每次2 mL，每日1次。扶正透邪方最佳劑量組腹腔注射菌液后（5 mL/kg），即給予扶正透邪方提取物（0.99 g/mL）灌胃，每次2 mL，每日1次。7 d后留取以上各組大鼠血清標(biāo)本，進(jìn)行多肽陣列檢測(cè)。

1.8 檢測(cè)方法 1）多肽陣列合成。選擇銅綠假單胞菌耐藥蛋白序列中的金屬酶VIM-1（CAG23926）、SPM-1（AAR15341）和超廣譜內(nèi)酰胺酶（TEMs/ESBLs）TEM（ABB76656）3種蛋白質(zhì)，進(jìn)行多肽陣列制作。 （1）配置封閉液Ⅰ：選取 2%（v/v）aceticanhydride in DMF。封閉液 Ⅱ ：2% （v/v） acetic anhydride+2% （v/v） DIPEAin DMF，0.3 mol/L Fmoc-氨基酸溶液，去保護(hù)溶液［20%（v/v） piperidine in DMF］。 （2）把活化的 PEG-纖維素膜放置在Autospotter上，再根據(jù)程序?qū)?30 μL的Fmoc-氨基酸溶液自動(dòng)移液到活化的PEG-纖維素膜上的特定位置，并與膜進(jìn)行2次反應(yīng)、每次20 min。（3）把PEG-纖維素膜按照順序浸入到封閉液Ⅰ中（反應(yīng)時(shí)間5 min）和封閉液Ⅱ中（反應(yīng)時(shí)間20 min），之后進(jìn)行側(cè)鏈封閉，再進(jìn)行DMF清洗4次，每次30 s。（4）加入去保護(hù)溶液中，2次，每次5 min，用于移除氨基端的Fmoc保護(hù)基團(tuán)。（5）在去保護(hù)之后，用DMF清洗3次，每次30 s，然后用乙醇干燥。（6）完成全部合成后，用TFAcocktail將側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)去除，再用CH2Cl2清洗4次，然后用乙醇干燥，-20℃保存，用于下一步免疫反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。每張多肽陣列橫向?yàn)?2個(gè)多肽點(diǎn)，縱向?yàn)?個(gè)多肽點(diǎn)。2）多肽陣列與血清免疫反應(yīng)。（1）封閉：4%skim milk+5%sucrose in TBST buffer， 室溫 4 h。（2）一抗孵育：對(duì)血清進(jìn)行1∶200稀釋；然后與多肽陣列反應(yīng)，在4℃下過(guò)夜。（3）洗膜：用TBST buffer進(jìn)行漂洗，漂洗 3次、每次 10 min。 （4）二抗孵育：二抗（羊抗人）IgG-HRP， 用封閉液進(jìn)行 1∶1 000 或 1∶2 000 稀釋，在室溫下放置2 h。（5）洗膜：用TBST buffer漂洗，漂洗3次、每次10 min。（6）顯色：加入ECL發(fā)光試劑，進(jìn)行數(shù)字成像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清對(duì)VIM-1蛋白的影響比較 見(jiàn)表1，圖1?？瞻捉M大鼠血清對(duì)耐藥蛋白VIM-1的重疊多肽片段產(chǎn)生不同程度的抗體反應(yīng)，而銅綠假單胞菌感染后，血清抗體反應(yīng)的明顯變化表明，上表中多肽片段指征的耐藥蛋白VIM-1的抗原決定簇能夠激發(fā)大鼠的免疫反應(yīng)。芪歸銀方組大鼠中，針對(duì)表位7-11和36-40的抗體表達(dá)強(qiáng)度大于空白和模型組的抗體表達(dá)強(qiáng)度（均P＜0.05）；模型組中，針對(duì)53-54和56-58表位的抗體反應(yīng)強(qiáng)度降低（均P＜0.05），而芪歸銀方組的抗體反應(yīng)雖較正常組為低，但高于模型組大鼠 （P＜0.05）；與空白組比較，模型組和芪歸銀方組大鼠均產(chǎn)生針對(duì)23-25表位的較強(qiáng)抗體反應(yīng)，兩者之間比較差別不大（P＞0.05）；而模型組對(duì)80-81表位產(chǎn)生顯著的抗體反應(yīng)，但在空白組和芪歸銀方組中則無(wú)明顯反應(yīng)（均P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清對(duì)VIM-1的抗體表達(dá)比較（n）

圖1 各組大鼠血清對(duì)VIM-1的抗體表達(dá)差異

2.2 各組大鼠血清對(duì)SPM-1蛋白的影響比較 見(jiàn)表2，圖2?？瞻捉M大鼠血清對(duì)耐藥蛋白SPM-1的重疊多肽片段產(chǎn)生不同程度的抗體反應(yīng)，不相關(guān)抗體產(chǎn)生的非特異性反應(yīng)可能是其中部分原因，針對(duì)25-28、61-64和73-76抗原決定簇的抗體反應(yīng)最有可能是這一原因造成的，但各組間差別不大（均P＞0.05）。感染刺激大鼠產(chǎn)生新的更多地針對(duì)13-15和39-40表位的抗體，然而，相較于空白組和芪歸銀方組產(chǎn)生的針對(duì)16-19和82-85抗原的免疫反應(yīng)，模型組大鼠則產(chǎn)生的抗體反應(yīng)更弱（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清對(duì)SPM-1的抗體表達(dá)比較（n）

圖2 各組大鼠血清對(duì)SPM-1的抗體表達(dá)差異

2.3 各組大鼠血清對(duì)TEM-1蛋白的影響比較 見(jiàn)表3，圖3。銅綠假單胞菌感染后刺激大鼠免疫系統(tǒng)并且產(chǎn)生更強(qiáng)的針對(duì)多肽 19-21、26-27、52-55和66-70的反應(yīng)，且這些多肽可被認(rèn)為是特異性的抗原決定簇。各組大鼠血清中抗體針對(duì)的陽(yáng)性表位數(shù)目差別不大（均P＞0.05）；芪歸銀方組對(duì)TEM-1蛋白19-21和52-55表位的抗體反應(yīng)強(qiáng)于模型組和空白組 （均P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清對(duì)TEM-1的抗體表達(dá)比較（n）

圖3 各組大鼠血清對(duì)TEM-1的抗體表達(dá)差異

3 討 論

多肽陣列技術(shù)是一種高通量蛋白質(zhì)組研究工具，能用多肽模擬蛋白抗原與自身抗體結(jié)合，被認(rèn)為是后基因組時(shí)代與基因芯片、蛋白芯片相媲美的新型蛋白位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于藥物篩選、靶標(biāo)確認(rèn)、表位定位以及蛋白結(jié)構(gòu)功能和相互作用等研究，應(yīng)用前景廣闊［13-16］。本實(shí)驗(yàn)首次將多肽陣列技術(shù)引入到探索中藥復(fù)方對(duì)耐藥菌感染作用機(jī)制的研究中。檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白和模型相比較，芪歸銀方組大鼠在金屬酶蛋白VIM-1針對(duì)7-11和36-40表位的抗體反應(yīng)明顯增強(qiáng)，這說(shuō)明中藥治療能夠刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)這些表位的抗體。同時(shí)，針對(duì)表位7-11和36-40的抗體可能通過(guò)中和VIM-1耐藥蛋白誘發(fā)有益的效應(yīng)，并對(duì)大鼠機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。而對(duì)于金屬酶SPM-1而言，在銅綠假單胞菌感染后針對(duì)13-15和39-40表位出現(xiàn)更強(qiáng)的抗體反應(yīng)，表明感染刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，但芪歸銀方治療并沒(méi)有對(duì)上述抗體反應(yīng)產(chǎn)生可辨別的變化，表明對(duì)這些特異性抗體可能沒(méi)有產(chǎn)生影響。而對(duì)于TEM-1蛋白，芪歸銀方組較模型組大鼠血清針對(duì)26-27、52-55和66-70的抗體反應(yīng)增強(qiáng)，表明芪歸銀方可能通過(guò)刺激這些特異性抗體的產(chǎn)生而發(fā)揮其對(duì)感染后大鼠更佳的保護(hù)作用。上述結(jié)果與前期相關(guān)研究具有較好的一致性，相互印證了芪歸銀方能夠通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)，糾正耐藥菌感染后導(dǎo)致的免疫紊亂，具提高抗多重耐藥菌感染臨床療效的潛力與優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步深入研究。