毛 睿，劉亞男 ，李麗紅，田 盼，王 迎，竇志英，王 飄

（天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

麻黃為麻黃科植物草麻黃（Ephedra sinica Stapf）中麻黃（Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.）或木賊麻黃（Ephedra equisetina Bye.）的干燥草質(zhì)莖，是一種常用中藥，其性溫，味辛、微苦，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫的功能[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主中風，傷寒頭痛，溫瘧，發(fā)表出汗，去邪熱氣，止咳逆上氣，除寒熱，破癥堅積聚?！盵2-3]麻黃的化學成分復雜，含有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油、有機酚酸、糖類及鞣質(zhì)、單萜糖苷類、木脂素類等多種化學成分[4-5]，藥理作用豐富[6-7]。2015年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）規(guī)定以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總質(zhì)量分數(shù)不得少于0.80%作為麻黃質(zhì)量控制的標準，而麻黃有諸多功效，且其量有限，導致市場混亂。

本研究共收集31個批次的麻黃飲片，依照《中國藥典》進行浸出物、灰分、水分檢測；采用HPLC測定31批麻黃飲片中麻黃堿和偽麻黃堿的含量；運用化學計量學，即利用計算機系統(tǒng)和相應的程序分析采集到的藥材及飲片的總成分提取物的光譜、色譜數(shù)據(jù)以及某些經(jīng)量化后的指標，獲取用于中藥材分析鑒別的有用信息，運用計算機代替人力對中藥材進行分類和鑒別真?zhèn)?。近年來CA、PCA及PLS-DA已廣泛應用于中藥質(zhì)量評價[8-11]。建立兩種無監(jiān)督的化學模式識別方法：CA、PCA以及一種有監(jiān)督的化學模式識別方法PLS-DA對麻黃飲片質(zhì)量進行整體分析，初步闡述了麻黃飲片的質(zhì)量等級分類標準，對臨床安全用藥及制劑、調(diào)劑都具有重要的意義。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗儀器 HPLC高效（島津LC-2010AHT，LC solution工作站），超聲波清洗器KQ-250E（昆山市超聲洗器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司），F(xiàn)A2004電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），F(xiàn)W100高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 實驗材料 采集中國31個不同廠家批次的麻黃飲片，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學中藥學院李天祥教授鑒定均為麻黃科植物草麻黃Ephdra sinica Stapf.的干燥草質(zhì)莖，詳見表1。乙腈為色譜純（SIGMAALORICH），水為娃哈哈純凈水，磷酸及三乙胺購自天津市化學試劑供銷公司，麻黃堿對照品（No.171241-201508）、偽麻黃堿對照品（No.171237-2015010）購自中國藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 含水量、總灰分及水溶性浸出物的含量測定按2015年版《中國藥典》通則0832項下水分測定中烘干法、通則2201項下冷浸法中水溶性浸出物測定法、通則2302項下總灰分測定法測定。31批麻黃飲片含水量范圍為2.36%～5.33%；浸出物含量范圍 13.05%～28.11%；灰分含量范圍為 5.84%～8.94%，均符合2015年版《中國藥典》的要求。

表1 實驗麻黃飲片

2.2 麻黃堿與偽麻黃堿含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜條件的選擇，對《中國藥典》2015年版1部的規(guī)定中麻黃藥材的色譜條件進行優(yōu)化，文獻記錄研究者采用乙腈∶0.1%磷酸水溶液（3∶97）為流動相，測定麻黃堿與偽麻黃堿，分離度良好。通過實踐發(fā)現(xiàn)，流動相中加入0.1%的三乙胺，可以將麻黃堿、偽麻黃堿完全分離，且分離度良好。本實驗采用色譜條件如下：色譜柱：Kromasil C18柱250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動相：0.1%磷酸溶液（0.1%三乙胺）（A）-乙腈（B）=96∶4，等度洗脫，流速：1 mL/min，柱溫：25℃，檢測波長：210 nm，進樣量10 μL。麻黃藥材及標準品HPLC色譜圖見圖1，分離效果很好。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品、鹽酸偽麻黃堿對照品適量于100mL容量瓶，加甲醇制得麻黃堿42 μg/mL、偽麻黃堿38 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品細粉約0.5000g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率600 W，頻率50 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用 1.44%磷酸溶液補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系 分別精密移取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿儲備液適量，用甲醇稀釋一系列濃度的對照品溶液，鹽酸麻黃堿的濃度分別為，鹽酸偽麻黃堿的濃度分別為，進樣量10 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，鹽酸麻黃堿的線性方程為Y=530 3761.71X-4684445.67，線性范圍在 50～1210μg/mL，r=0.9999；鹽酸偽麻黃堿的線性方程為Y=16 169 601.74X+104 113 9.70，線性范圍在 40～960 μg/mL，r=0.999 9。

2.3.2 精密度實驗 取“2.2.2”項下混標溶液，在“2.2.1”項下色譜條件下，連續(xù)進樣6針，記錄麻黃堿與偽麻黃堿的峰面積并計算RSD值。麻黃堿、偽麻黃堿RSD值分別為0.29%、0.62%。表明儀器精密度良好。

圖1 麻黃藥材（A）和標準品（B）HPLC色譜圖

2.3.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件在 0、2、4、8、12h 分別進樣，進樣 10μL，記錄峰面積并計算RSD值。麻黃堿與偽麻黃堿RSD值分別為2.14%，1.87%。表明樣品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復性實驗 精密稱取同一個樣品6份，按“2.2.3”提取處理方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積，計算各對照品的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果顯示麻黃堿與偽麻黃堿RSD值分別為2.17%、2.15%，表明方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的麻黃飲片粉末9份，每份0.25 g，按照表加入對照品溶液。按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分析，結(jié)果見表2。

2.3.6 將31批樣品按“2.3.3”提取處理方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件進行分析，測定峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 無監(jiān)督化學模式識別 運用SPSS 19.0軟件對31批麻黃飲片進行系統(tǒng)聚類分析。本研究以其水分、灰分、浸出物、麻黃堿含量、偽麻黃堿含量和總含量為指標，采用組間連接法，利用歐式距離作為樣品的測度，對數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見圖4。本次系統(tǒng)聚類分析可分為兩大類：S12、S13、S14、S15、S6、S30、S31分為一類，剩余為另一類，與PCA、PLS-DA 分類一致，且 S12、S13、S14、S15、S6、S30、S31麻黃飲片質(zhì)量均一，麻黃堿、偽麻黃堿總含量較高。

表2加樣回收率實驗結(jié)果

將31批麻黃飲片的水分、灰分、浸出物、麻黃堿含量、偽麻黃堿含量和兩者總含量為分析變量，導入SIMCA-P 11.5統(tǒng)計軟件進行主成分分析，主成份分析法作為數(shù)據(jù)挖掘的一種方法，將高維空間的問題轉(zhuǎn)化到低維空間處理，在不損失或較少損失原有指標信息特征的情況下，將多個具有相關(guān)性的指標轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個相互獨立的綜合指標（即主成分），從而使繁多的求解目標簡化[12]，見圖2。采用主成份分析來描述生麻黃飲片質(zhì)量的分布情況，根據(jù)特征值獲取的結(jié)果兩個主成份的累積貢獻率達到了98.0%，其中PC1（即麻黃堿與偽麻黃堿總含量）貢獻率達到了71.2%，為分類中的關(guān)鍵因素，能反映大部分質(zhì)量信息。交叉驗證系數(shù)為0.766，說明模型預測能力合理，見圖3。主成份分析分析結(jié)果表明，麻黃飲片可分為兩類。

主成份分析與聚類分析過程中能自動生成各主成份的權(quán)重，在很大程度上避免了人為因素在評價過程中的干擾；主成份分析能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，對提取的數(shù)據(jù)進行客觀充分的多元分析，因此兩者能較好地保證評價結(jié)果的客觀性。

2.4.2 有監(jiān)督化學模式識別 偏最小二乘法判別分析，是判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法。判別分析是一種根據(jù)觀察或測量到的若干變量值，來判斷研究對象如何分類的常用統(tǒng)計分析方法。其原理是對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進行訓練，產(chǎn)生訓練集，并檢驗訓練集的可信度。本研究將31批麻黃飲片的水分、灰分、浸出物、麻黃堿含量、偽麻黃堿含量和兩者總含量為分析變量，導入SIMCA-P 11.5統(tǒng)計軟件進行偏最小二乘回歸的計算，建立有監(jiān)督的模式識別模型偏最小二乘法判別分析，根據(jù)軟件自動擬合31批麻黃飲片的質(zhì)量信息，將31批麻黃飲片分為兩類，可驗證主成份分析結(jié)果，得散點圖4，本實驗所擬合的模型解釋能力參數(shù)R2X=0.705，R2Y=0.809，預測能力參數(shù)Q=0.788，表示所建模型穩(wěn)定、合理。故由以上實驗結(jié)果可將麻黃飲片分為兩個等級。

表3 31批麻黃飲片中麻黃堿與偽麻黃堿浸出物、水分、總灰分、麻黃堿、偽麻黃堿含量測定結(jié)果（n=6）%

3 討論與結(jié)論

圖2 31批麻黃飲片聚類圖

圖3 31批麻黃飲片主成份分析分結(jié)

圖4 31批麻黃飲片偏最小二乘法回歸分析結(jié)果

本研究共收集了31批麻黃飲片，建立優(yōu)化的HPLC含量測定條件，增加水溶性浸出物作為檢測指標，并依據(jù)2015年版《中國藥典》進行了水分、灰分以及水溶性浸出物含量測定，初步評價了麻黃飲片的質(zhì)量。但目前《中國藥典》僅規(guī)定了藥材的合格標準，而優(yōu)質(zhì)的中藥飲片是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)中成藥的必要條件，因此，制定藥材的等級標準勢在必行。研究采用兩種無監(jiān)督的化學模式識別模型將麻黃飲片分為兩類，由主成份分析給出麻黃堿與偽麻黃堿總含量為優(yōu)質(zhì)分類的關(guān)鍵因素，且水分、灰分、浸出物受人為影響較大，故本實驗以麻黃堿與偽麻黃堿的總含量為分級標準將31批麻黃飲片分為兩個等級，優(yōu)等：麻黃堿及偽麻黃堿總含量≥2.6%；統(tǒng)貨：麻黃堿及偽麻黃堿總含量在0.8%～2.6%。并利用偏最小二乘法判別分析進一步驗證，以科學、客觀的質(zhì)量評價標準，取代以往僅憑外觀、經(jīng)驗等主觀的質(zhì)量評價方法，對于有效監(jiān)控飲片質(zhì)量具有現(xiàn)實意義[13]。本實驗只對麻黃中草麻黃的麻黃飲片進行了研究，擬定的各項指標限量在蜜炙麻黃以及木賊麻黃和中麻黃中有待進一步研究。