方玉松 劉峻嶺 張志平 王宗明 尹立國 許鵬

食管癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，病死率高，危害極大。我國是食管癌的高發(fā)地區(qū)，病理類型以食管鱗癌為主[1]。盡管近年來手術(shù)技術(shù)和藥物治療手段取得一定的進步，但絕大多數(shù)食管癌患者仍難免死于腫瘤局部復發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移，5年總體生存率仍較低[2]。食管癌的形成過程中牽涉到一系列基因和表觀遺傳學變化，具體作用機制尚不清楚。雖然近年來的研究在分子生物學水平上取得了很大的進展，發(fā)現(xiàn)了食管癌發(fā)生發(fā)展中許多重要的分子事件，但仍不能有效地做到早期檢測、早期診斷和特異性治療。因此，對食管癌發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究是早期診斷和治療食管癌、提高食管癌患者生存率的關(guān)鍵。

微小RNA(microRNA,miRNA)是一組由19～25個核苷酸組成的單鏈非編碼小RNA，在機體基因調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮著重要的作用[3]。越來越多的研究已證實miRNA能夠調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，并且在腫瘤的早期診斷、特異性治療及預后判斷方面具有良好的前景[4]。在食管癌的發(fā)生進展過程中目前也發(fā)現(xiàn)了許多異常表達的miRNA[5]。miR-125b是miRNA家族的重要成員之一，研究顯示miR-125b在胃癌[6]、甲狀腺癌[7]、骨肉瘤[8]等許多惡性腫瘤中表達異常,與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學行為密切相關(guān)，參與了惡性腫瘤的發(fā)生、進展過程。但目前有關(guān)miR-125b在食管鱗癌中的研究甚少。本研究檢測了miR-125b在食管鱗癌組織和細胞中的表達變化，并進一步分析其與患者臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系，以期為食管癌的早期診斷及預后判斷提供新的方向。

材料與方法

一、 研究對象

1. 組織標本和資料：選取2012年1月—2013年1月在山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院行手術(shù)切除的89例食管癌手術(shù)標本，均經(jīng)術(shù)后病理學檢查確診為鱗狀細胞癌。癌組織標本取自手術(shù)切除標本中肉眼觀察的腫瘤組織，癌旁組織標本取自距離腫瘤邊緣至少5 cm的無瘤組織標本。標本離體后立即液氮暫存，后保存于-80 ℃冰箱待測。89例患者均具有完整的臨床病歷資料，術(shù)前均未進行化療、放療等特殊抗腫瘤治療，于術(shù)后開始隨訪，隨訪至患者死亡或者術(shù)后5年，失訪及其他原因的死亡作為截尾數(shù)據(jù)。所有患者對本研究知情，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

2. 細胞和主要試劑:人低分化食管鱗癌細胞系KYSE410、TE-13，人高分化食管鱗癌細胞系EC9706、KYSE510及人正常食管細胞系Het-1均購自中國科學院上海細胞研究所。所有細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(青霉素100 mg/L、鏈霉素100 mg/L)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，每隔2～3 d傳代1次。TRIzol試劑購自北京天根生化公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒購自大連TaKaRa公司；PCR引物由廣州銳博生物科技公司設計合成。

二、 qRT-PCR檢測miR-125表達

按照TRIzol試劑說明書操作分別提取食管鱗癌組織、癌旁組織、食管鱗癌細胞系中的總RNA。取100 ng總RNA, 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板進行qRT-PCR擴增，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒說明書配置反應體系進行反應。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火34 s，擴增40個循環(huán)。miR-125引物：正向：5′-TCCCTGAGACC CTAACT TGTGA-3′，反向：5′-GCGAGCACAGAATTAATA CGAC-3′；內(nèi)參U6引物：正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA TACT-3′，反向：5′-ACGCTTC ACGAATTT GCGTGTC-3′。以2-△△Ct法表示miR-125b的相對表達量。

三、 統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、 miR-125b的表達

1. 體外培養(yǎng)的食管鱗癌細胞和食管正常細胞：qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，食管鱗癌細胞(KYSE410、TE-13、EC9706、KYSE510)中miR-125b的表達顯著低于正常食管細胞Het-1A(P<0.05)，且在低分化食管鱗癌細胞(KYSE410、TE-13)中miR-125b的表達顯著低于高分化食管鱗癌細胞(EC9706、KYSE510)(P<0.05)(圖1A)。

2. 食管鱗癌組織和癌旁組織標本

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中miR-125b表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)(圖1B)。

二、 miR-125b的表達與食管鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

以miR-125b的中值為界值，將患者分為低表達組45例和高表達組44例。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示：miR-125b低表達與pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤長度及浸潤深度無關(guān)(P>0.05)(表1)。

圖1 miR-125b的表達。A. miR-125b在體外培養(yǎng)的食管鱗癌細胞和食管正常細胞中的表達。1～5分別表示Het-1、EC9706、KYSE510、KYSE410、TE-13。與Het-1比較，*P<0.05；與EC9706比較，#P<0.05；與KYSE510比較，△P<0.05。B. miR-125b在食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達。與癌旁組織比較，*P<0.05

參數(shù)低表達組(N=45)高表達組(N= 44)χ2值P值性別0.2790.597 男性32(52.46)29(47.54) 女性 13(46.43)15(53.57)年齡/歲1.4650.226 ≥ 60性40(53.33)35(46.67) <60性5(35.71)9(64.29)分化程度5.2980.021 中高分化22(40.74)32(59.26) 低分化23(65.71)12(34.29)腫瘤長度2.5890.108 ≥ 5 cm24(60.00)16(40.00) < 5 cm21(42.86)28(57.14)pTNM分期5.9510.015 Ⅰ期+ⅡA期17(37.78)28(62.22) ⅡB期+Ⅲ期28(63.64)16(36.36)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移8.4610.004 有26(68.42)12(31.58) 無19(37.25)32(62.75)

三、 食管鱗癌組織中miR-125b表達與患者預后的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示：miR-125b低表達組總生存率顯著低于miR-125b高表達組(P<0.05)(圖3)。Cox回歸多因素分析顯示：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期、miR-125b低表達是食管癌根治術(shù)后患者 預后的獨立影響因子(P<0.05)(表2)。

圖3 食管鱗癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

因素HR95% CIP值性別1.4490.901～2.4210.119年齡1.1260.757～1.8970.178分化程度0.7240.495～1.2140.226腫瘤長度1.3540.799～2.2500.137pTNM分期2.2681.517～4.0140.031淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移2.7811.716～4.4360.014miR-125b表達3.1472.358～5.5780.009

討 論

食管癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率均較高的惡性腫瘤之一，雖然食管癌的手術(shù)治療及放化療方面在一定程度上取得了進步，但由于食管癌的早期診斷困難，其5年生存率仍沒有取得明顯的提高，因此尋找能夠用于食管癌篩選、早期診斷及預后判斷的有效的分子標志物意義重大，也是目前研究的熱點問題。目前，食管癌發(fā)生發(fā)展的具體機制尚不完全明確，研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在惡性腫瘤中異常表達，調(diào)控惡性腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在腫瘤的早期診斷、預后判斷方面起著重要的作用，已成為目前腫瘤研究的熱點問題[9]。研究已經(jīng)證實，許多miRNA表達失衡在食管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，與食管癌的分期及預后密切相關(guān)[10]。Chang等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)miR-655在食管癌中表達降低，并且與食管癌的不良預后密切相關(guān)，上調(diào)miR-655的表達能夠抑制食管癌細胞的增殖和侵襲。陳述等[12]通過基因芯片技術(shù)對中國新疆地區(qū)食管癌組織中miRNA水平進行篩查，最終通過qRT-PCR證實miR-181c-3p和miR-5692b在食管癌組織中表達升高，并且認為miR-181c-3p和miR-5692b可作為食管癌進展和預后的潛在預測指標。

miR-125b是近期新發(fā)現(xiàn)的miRNA家族成員之一，定位于人類染色體19q13，研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)控腫瘤細胞增殖、凋亡、分化、侵襲及轉(zhuǎn)移等眾多腫瘤細胞生物學活性方面發(fā)揮著重要作用[13]。既往研究顯示miR-125b在胃癌[6]、腎細胞癌[14]等癌組織中表達增高，作為癌基因發(fā)揮作用，而在甲狀腺癌[7]、骨肉瘤[8]、乳腺癌[15]等癌組織中表達降低，作為抑癌基因發(fā)揮作用。因此認為，miR-125b可能在不同的腫瘤、不同的上下游通路中發(fā)揮著不同的作用。本研究中我們通過qRT-PCR檢測了食管鱗癌組織、癌旁組織和食管鱗癌細胞系、人正常食管細胞系中miR-125b的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-125b在食管鱗癌組織中的表達較癌旁組織明顯降低，并且miR-125b在食管鱗癌細胞系中的表達較人正常食管細胞系明顯降低，提示miR-125b在食管鱗癌中可能起著抑癌基因的作用。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，miR-125b在低分化食管鱗癌細胞中的表達顯著低于高分化食管鱗細胞，并且食管鱗癌組織中miR-125b低表達與pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分化程度相關(guān)，進一步提示miR-125b的異常低表達與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

目前有關(guān)miR-125b表達異常與惡性腫瘤患者預后關(guān)系的研究較少。Wu等[6]在研究中發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-125b的異常高表達的胃癌患者5年生存率較低。Li等[16]報道腦膠質(zhì)瘤組織中miR-125b高表達的患者預后較差。Luo等[17]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者血清中miR-125b低表達患者無病生存期和總生存期較短。至今尚未見miR-125b與食管鱗癌患者預后關(guān)系的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b低表達組患者的預后較差，并且miR-125b低表達是影響食管癌根治術(shù)后患者預后的獨立影響因子。

綜述所述，miR-125b在食管鱗癌組織和細胞中表達異常降低，食管鱗癌中miR-125b的異常低表達與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預后具有相關(guān)性，為尋找食管鱗癌早期診斷及預后預測分子生物學標志物提供了新的參考。