孫燕，覃小麗，鐘金鋒，劉雄

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

辣木(MoringaoleiferaLam.)為辣木科辣木屬植物，原產(chǎn)于印度北部喜馬拉雅山南麓[1]。辣木具有良好的保健功能和生理活性，其根、莖、葉、種子、花朵等均可食用[2]。辣木籽中含有豐富的油脂、蛋白質(zhì)及礦物元素。其中，辣木籽油中富含不飽和脂肪酸，油酸含量高達(dá)75.39%[3-4]，且含有飽和烴、醛及植物甾醇[5-6]，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。因此，研究一種高效提取辣木籽中油脂等營養(yǎng)成分的方法，為功能食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

目前，植物油脂提取多采用有機(jī)溶劑浸提法，這種方法油脂提取率較高，但此過程涉及易燃、易爆化學(xué)試劑，易導(dǎo)致有機(jī)溶劑殘留且存在一定的安全問題[7]。水酶法是利用酶解作用破壞油料細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，從而將油脂釋放出來，該方法條件溫和，提取工藝簡單，無溶劑殘留。劉華勇[8]研究了蛋白酶種類、酶解時(shí)間、酶添加量等條件對辣木籽油提取率的影響，酶解24 h后辣木籽油提取率為70.09%。已報(bào)道的水酶法提取辣木籽油提取率較低且酶解時(shí)間大都較長(通常為24 h)[8-9]。而預(yù)處理(高溫高壓、微波、超聲等)方法與水酶法相結(jié)合可以有效地提高油脂提取效率。YUSOFF等[10]采用高壓(50 MPa，60 ℃，35 min)預(yù)處理方法輔助水酶法提取辣木籽油，油脂提取率可達(dá)73%，并且與傳統(tǒng)水酶法相比乳化層更薄，但酶解時(shí)間較長(12.5 h)。近年來，預(yù)處理方法與水酶法結(jié)合的研究多集中在茶葉籽油[11]、西瓜籽油[12]、橄欖油[13]等植物油的提取，但在提取辣木籽油中應(yīng)用較少，且不同預(yù)處理方法對辣木籽油提取率及微觀表面形貌和結(jié)構(gòu)的影響尚未見報(bào)道。

本文以辣木籽為原料，在傳統(tǒng)水酶法的基礎(chǔ)上，結(jié)合微波、高壓和超聲3種不同的預(yù)處理方法，考察3種預(yù)處理對辣木籽油提取率的影響，并與傳統(tǒng)水酶法的提取效果進(jìn)行對比。進(jìn)一步借助掃描電鏡分析辣木籽在預(yù)處理前后微觀表面形貌及結(jié)構(gòu)的變化，初步探究不同預(yù)處理方法提取辣木籽油的機(jī)理，以期提高辣木籽油的提取效率以及為辣木籽的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木籽，云滇養(yǎng)生堂；中性蛋白酶Neutrase 0.8 L，丹麥諾維信公司；其他試劑均屬于分析純；超純水，由YSL-RO-T10L/H超純水系統(tǒng)(Ashland公司)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-300型高速多功能粉碎機(jī)，上海拜杰實(shí)業(yè)有限公司；EG823LA6-NR型微波爐，美的公司；手提式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Scientz-800CQ型超聲波提取震蕩反應(yīng)器，寧波新芝生物科技股份有限公司；SHZ-88水浴恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司；RW20數(shù)顯型混合頂置式機(jī)械攪拌器，德國IKA公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PB-10 pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取方法

辣木籽→脫殼→粉碎→過篩→與水混合→水浴加熱→冷卻→預(yù)處理(微波、高壓、超聲)→調(diào)pH 6.0→酶解→滅酶→離心

操作要點(diǎn)：辣木籽脫殼粉碎，過60～80目篩。辣木籽粉與超純水以1∶6質(zhì)量比混勻，96 ℃水浴9 min，冷卻至室溫。分別經(jīng)微波、高壓、超聲預(yù)處理后，用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl調(diào)其pH為6.0。樣品中添加中性蛋白酶(1.5×105U/100g辣木籽粉)于水浴恒溫振蕩器(45 ℃，120 r/min)進(jìn)行酶解反應(yīng)。酶解后于95 ℃水浴滅酶30 min。離心(8 000 r/min，20 min)后得到游離油、乳狀液、水解液及殘?jiān)?。微波預(yù)處理時(shí)采用微波間歇加熱方法，即微波加熱1 min后冰水浴冷卻1 min，再微波1 min，反復(fù)進(jìn)行，以防止提取液暴沸。未進(jìn)行預(yù)處理的為對照組。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

在提取過程中，考察微波(功率、時(shí)間、酶解時(shí)間)、高壓(溫度、時(shí)間、酶解時(shí)間)、超聲(功率、時(shí)間、酶解時(shí)間)預(yù)處理?xiàng)l件對辣木籽油提取率的影響。

1.4 辣木籽油和蛋白質(zhì)的提取率的計(jì)算

辣木籽油和蛋白提取率的計(jì)算分別如式(1)和(2)。

(1)

(2)

式中：m1，游離油的質(zhì)量，g；m2，辣木籽粉中粗脂肪的質(zhì)量，g；m3，辣木籽粉中粗蛋白質(zhì)量，g；m4，殘?jiān)械鞍踪|(zhì)量，g。其中，粗脂肪含量和蛋白質(zhì)含量測定分別根據(jù)GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》和GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，各樣品的指標(biāo)平行測定至少3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示結(jié)果。采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(P<0.05時(shí)判斷組間存在顯著差異)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波預(yù)處理對辣木籽油提取率的影響

2.1.1 微波功率對辣木籽油提取率的影響

在微波時(shí)間3 min，酶解時(shí)間3 h的條件下，微波功率(100～800 W)對辣木籽油提取率的影響如圖1-A所示。當(dāng)微波功率從100 W增大到300 W時(shí)，辣木籽油的提取率由52.54%顯著升高至58.75%(P<0.05)，這可能是因?yàn)槔蹦咀逊畚瘴⒉崮芎?，溫度快速升高，辣木籽?xì)胞在微波電磁場作用下粒子之間相互碰撞，使得細(xì)胞壁破裂，油脂流動(dòng)性增加，其內(nèi)部的油脂得以釋放[14-15]。當(dāng)微波功率在300～800 W時(shí)，油脂提取率趨于平緩，這可能是因?yàn)殡S著微波功率的增大，酶對蛋白的水解作用達(dá)到飽和，蛋白質(zhì)的提取率不再顯著性上升(P>0.05)，油脂提取接近平衡狀態(tài)，這與仵緣等[15]用微波輔助溶劑法提取橡膠籽所得結(jié)果類似。胡濱等[16]在微波功率300～800 W也得出相似的結(jié)論。因此，選擇提取辣木籽油的微波功率為300 W。

2.1.2 微波時(shí)間對辣木籽油提取率的影響

在微波功率300 W，酶解時(shí)間3 h的條件下，微波時(shí)間(0～9 min)對辣木籽油提取率的影響如圖1-B所示。

圖1 微波功率(A)和時(shí)間(B)對辣木籽油提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power (A) and time (B) on oil recovery from the Moringa oleifera seed powder

當(dāng)微波時(shí)間從0增加到5 min時(shí)，油脂提取率增加了5.57%。一方面，可能是隨著微波時(shí)間的增加，微波輻射對細(xì)胞壁的破壞作用增大，增加了細(xì)胞的通透性[17]；另一方面隨著提取時(shí)間的進(jìn)行，更多的蛋白被酶水解，蛋白提取率顯著增加(4.81%)，說明蛋白質(zhì)在酶解液中溶解度增大，這使被蛋白質(zhì)包圍的油脂得以釋放。當(dāng)微波處理時(shí)間超過5 min后，油脂釋放較少，提取率(60.87%)不再顯著增加(P>0.05)。提取過程中，蛋白提取率和油脂提取率呈相似趨勢，可能說明油脂釋放與蛋白水解在一定程度上呈正相關(guān)。

2.1.3 微波預(yù)處理酶解時(shí)間對辣木籽油提取率的影響

在微波功率300 W，微波時(shí)間5 min的條件下，酶解時(shí)間(0.5～5 h)對辣木籽油提取率的影響如圖2所示。酶解時(shí)間從0.5 h延長至1 h時(shí)，油脂提取率從50.26%迅速增大至62.09%，這可能是由于隨著酶解時(shí)間的延長，蛋白酶充分水解細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)(蛋白提取率從26.56%提高至44.63%)，使油脂大量溶出。當(dāng)酶解時(shí)間從1 h延長至3 h，油脂提取率提高不顯著(P>0.05)；酶解時(shí)間繼續(xù)至5 h時(shí)，雖然蛋白提取率增加了5.77%，但是油脂提取率下降了3.70%，這可能是長時(shí)間的酶解和振蕩使大量蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)酶解物與辣木籽油發(fā)生乳化。為了提高油的提取率，選擇提取辣木籽油的酶解時(shí)間為1 h。

圖2 酶解時(shí)間對辣木籽油提取率的影響Fig.2 Effect of reaction time on oil recovery from theMoringa oleifera seed powder注：不同字母表示差異顯著。下同。

2.2 高壓預(yù)處理對辣木籽油提取率的影響

2.2.1 高壓溫度對辣木籽油提取率的影響

在高壓時(shí)間10 min，酶解時(shí)間3 h的條件下，高壓溫度(100～120 ℃)對辣木籽油提取率的影響如圖3-A所示。當(dāng)高壓溫度達(dá)到110 ℃時(shí)，油脂提取率由60.43%提高至65.71%，這可能是因?yàn)楦邏河行У厥辜?xì)胞壁膨松、淀粉糊化，增加其滲透性[18-19]，因而有利于酶的作用使蛋白質(zhì)提取率增加了20.73%，促進(jìn)油脂釋放。繼續(xù)升高溫度至120 ℃時(shí)，油脂提取率下降了3.97%。這可能是因?yàn)楦邷厥沟鞍踪|(zhì)變性，蛋白質(zhì)提取率提高不顯著(P>0.05)；且部分油脂在此條件下易被乳化。因此，選擇提取辣木籽油的高壓溫度為110 ℃。

2.2.2 高壓時(shí)間對辣木籽油提取率的影響

在高壓溫度110 ℃，酶解時(shí)間3 h的條件下，高壓時(shí)間(0～20 min)對辣木籽油提取率的影響如圖3-B所示。隨著高壓時(shí)間從0升高到10 min，辣木籽油提取率增加了8.96%，辣木蛋白提取率增加了14.96%，這可能是由于較長時(shí)間的高溫高壓作用使細(xì)胞壁變得更加松弛，酶更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與蛋白質(zhì)發(fā)生作用[19]，從而提高了出油率。當(dāng)繼續(xù)增加高壓時(shí)間至20 min，辣木籽油的釋放接近平衡狀態(tài)，提取率呈平緩趨勢。因此，選擇提取辣木籽油的高壓時(shí)間為10 min。

圖3 高壓溫度(A)和時(shí)間(B)對辣木籽油提取率的影響Fig.3 Effect of highpress temperature (A) and time (B) on oil recovery from the Moringa oleifera seed powder

2.2.3 高壓預(yù)處理酶解時(shí)間對辣木籽油提取率的影響

在高壓溫度110 ℃，高壓時(shí)間10 min的條件下，高壓預(yù)處理酶解時(shí)間(0.5～5 h)對辣木籽油提取率的影響如圖4-A所示。酶解時(shí)間從0.5 h延長至2 h時(shí)，油脂提取率從56.17%提高至65.48%，這可能是由于隨著酶解時(shí)間的延長，更多的蛋白被水解(蛋白提取率增加了10.07%)，促進(jìn)了油脂的釋放。當(dāng)酶解時(shí)間延長至5 h，油脂提取率顯著下降(油脂提取率從65.71%降低至57.14%)，這可能是因?yàn)楦邷馗邏鹤饔靡约伴L時(shí)間酶解作用，使大量的蛋白質(zhì)及蛋白酶解物與油脂發(fā)生乳化(圖4-B)。YUSOFF等[10]研究了辣木籽粉在高壓預(yù)處理(50 MPa，60 ℃，35 min)后酶解12.5 h，辣木籽油提取率為73.02%，而本試驗(yàn)在高壓預(yù)處理(110 ℃，10 min)后酶解2 h即可達(dá)到相近的提取率(65.48%)，有效地縮短了提取時(shí)間，因此，高壓預(yù)處理可顯著提高油脂提取效率。

圖4 酶解時(shí)間對辣木籽油提取率(A)和乳狀液形成(B)的影響Fig. 4 Effect of reaction time on oil recovery (A) and cream emulsion formed (B) from the Moringa oleiferaseed powder

2.3 超聲預(yù)處理對辣木籽油提取率的影響

2.3.1 超聲功率對辣木籽油提取率的影響

在超聲時(shí)間10 min，酶解時(shí)間3 h的條件下，超聲功率(40～720 W)對辣木籽油提取率的影響如圖5-A所示。當(dāng)超聲功率從40 W升高到720 W，油脂提取率降低了6.96%，這可能是因?yàn)檩^強(qiáng)的超聲功率使蛋白質(zhì)分子聚集，溶解度下降(蛋白提取率下降了6.16%)，不利于油脂釋放[20-22]。因此，選擇提取辣木籽油的超聲功率為40 W。

2.3.2 超聲時(shí)間對辣木籽油提取率的影響

在超聲功率40 W，酶解時(shí)間3 h的條件下，超聲時(shí)間(10～50 min)對辣木籽油提取率的影響如圖5-B所示。當(dāng)超聲時(shí)間從10 min升高到20 min，油脂提取率從58.96%顯著提高至66.29%(P<0.05)，這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的延長，超聲波的空化作用及機(jī)械振蕩作用對原料組織的細(xì)胞破碎程度增大，使其內(nèi)部的油脂得以釋放[23-24]。超聲時(shí)間20～40 min，油脂提取率變化不明顯。超聲時(shí)間繼續(xù)至50 min，油脂提取率降低了2.32%，這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長，蛋白分子發(fā)生聚集，不利于酶的作用使蛋白提取率降低了3.13%，抑制了油脂的釋放。因此，選擇提取辣木籽油的超聲時(shí)間為20 min。

圖5 超聲功率(A)和時(shí)間(B)對辣木籽油提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power (A) and time (B) on oil recovery from the Moringa oleifera seed powder

2.3.3 酶解時(shí)間對辣木籽油提取率的影響

在超聲功率40 W，超聲時(shí)間20 min的條件下，酶解時(shí)間(0.5～5 h)對辣木籽油提取率的影響如圖6-A所示。隨著酶解時(shí)間從0.5 h升高到1 h，油脂提取率顯著提高了4.86%(P<0.05)，這可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長，蛋白溶解度增大(蛋白提取率提高了4.54%)，使被蛋白包圍的油脂得以釋放。酶解時(shí)間1 h到3 h油脂提取率變化不明顯。酶解時(shí)間繼續(xù)至5 h時(shí)，油脂提取率下降了3.15%，而蛋白提取率(42.05%)不再顯著增加(P>0.05)，這可能是因?yàn)榈鞍准暗鞍酌附馕锱c油脂發(fā)生乳化。超聲酶解1 h(圖6-A)和高壓酶解2 h(圖4-A)油脂提取率顯著高于微波酶解1 h(圖2)和對照酶解1 h(P<0.05)；另外，超聲預(yù)處理5 h乳化程度(圖6-B)小于其他預(yù)處理(圖4-B)，且蛋白提取率低于其他處理組。這說明超聲在提高油脂提取率的基礎(chǔ)上還可以在一定程度上緩解油脂嚴(yán)重乳化現(xiàn)象。ABDULKARIM等[25]研究表明，不經(jīng)預(yù)處理輔助水酶法提取辣木籽油，酶解24 h后提取率為73.38%。也有研究通過堿提的方法水解蛋白質(zhì)促進(jìn)油脂的釋放，添加復(fù)合酶酶解24 h后，也可得到相近的提取率(70.09%)[8]。而本試驗(yàn)分別經(jīng)高壓和超聲預(yù)處理后酶解1～2 h，均可達(dá)到相近的提取率，大大縮短了提取時(shí)間，有效提高了油脂提取效率。

圖6 酶解時(shí)間對辣木籽油提取率(A) 和乳狀液形成(B)的影響Fig. 6 Effect of reaction time on oil recovery (A) and cream emulsion formed (B) from the Moringa oleiferaseed powder

2.4 不同預(yù)處理對辣木籽表觀結(jié)構(gòu)分析

與傳統(tǒng)水酶法相比，3種預(yù)處理方法均能顯著提高油脂提取率，其中超聲和高壓處理效果最好，為了進(jìn)一步解釋這一結(jié)果，通過掃描電鏡對預(yù)處理提取前后辣木籽粉的微觀表面形貌進(jìn)行觀察，分析不同預(yù)處理提取辣木籽油的機(jī)理，結(jié)果如圖7所示。

A-提取前;B-水酶法提取后;C-微波+水酶法提取后;D-高壓+水酶法提取后;E-超聲+水酶法提取后圖7 辣木籽掃描電鏡圖(×1 500)Fig.7 The images of scanning electron microscope

提取前辣木籽粉呈不規(guī)則圓形，表面較為粗糙(圖7-A)。不經(jīng)預(yù)處理的水酶法提取使辣木籽結(jié)構(gòu)明顯膨脹、體積增大(圖7-B)。微波處理是利用微波的熱效應(yīng)在短時(shí)間內(nèi)升高其內(nèi)部溫度，使結(jié)構(gòu)變得膨脹，經(jīng)酶解后辣木籽粉表面出現(xiàn)小的凹陷、卷曲和破碎(圖7-C)；高壓處理是利用高溫高壓的膨脹擠壓作用使辣木籽細(xì)胞組織松散、破碎，經(jīng)酶解后辣木籽粉呈不均勻的片狀結(jié)構(gòu)(圖7-D)；而超聲的機(jī)械振蕩作用能更徹底地破壞其表觀結(jié)構(gòu)，使辣木籽顆粒變得更加細(xì)小，有明顯的孔洞，更有利于油脂的釋放(圖7-E)。這說明，微波、高壓、超聲3種預(yù)處理輔助水酶法均有利于破壞辣木籽表觀結(jié)構(gòu)，促進(jìn)酶解作用，使得更多油脂被釋放，從而提高辣木籽油的提取率。其中超聲和高壓預(yù)處理對其結(jié)構(gòu)破壞程度最大，更有助于油脂的釋放，油脂提取率提高，這與單因素試驗(yàn)中超聲和高壓預(yù)處理油脂提取率較高的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

(1)微波酶解1 h油脂提取率為62.09%；高壓酶解2 h油脂提取率為65.48%；超聲酶解1 h油脂提取率為66.35%，而對照組油脂提取率僅為56.45%。說明3種處理方法均可以高效地提高油脂提取效率，其中超聲和高壓預(yù)處理效果更好。

(2)掃描電鏡結(jié)果表明，微波處理使辣木籽粉表面出現(xiàn)小的凹陷、卷曲和破碎；高壓處理使辣木籽粉呈不均勻的片狀結(jié)構(gòu)；而超聲使辣木籽顆粒變得更加細(xì)小，有明顯的孔洞。3種預(yù)處理輔助水酶法均不同程度地破壞了辣木籽的表觀結(jié)構(gòu)，其中超聲的空化和機(jī)械振蕩作用以及高壓的膨脹擠壓作用對其結(jié)構(gòu)的破壞效果更為明顯，更有利于蛋白酶水解細(xì)胞內(nèi)部的蛋白質(zhì)，促進(jìn)油脂釋放，這與單因素試驗(yàn)中超聲和高壓預(yù)處理油脂提取率較高的結(jié)果一致。因此，超聲和高壓預(yù)處理能夠有效地提取辣木籽油。