魯青，嚴(yán)美婷，張超鳳，張良

(江西省食品發(fā)酵研究所，江西 宜春，336000)

青錢柳是一種我國獨(dú)有的、重點(diǎn)保護(hù)的珍稀樹種，主要分布于江西、浙江等地[1-2]。研究表明，青錢柳含有多種有機(jī)活性物質(zhì)，如多糖、黃酮及三萜類等[3]，具有降血糖血脂、抗腫瘤、抗氧化、保肝護(hù)肝等多種功效，其中多糖和黃酮是其主要的功效成分之一[4-9]。目前青錢柳多糖及黃酮的提取多采用熱水浸提法、微波提取法和超聲波提取法等[10-12]，但提取率不高，且提取工藝只對多糖和黃酮進(jìn)行單獨(dú)提取，易造成原料的浪費(fèi)。而采用微生物發(fā)酵技術(shù)，利用微生物對青錢柳葉進(jìn)行發(fā)酵，破壞柳葉的細(xì)胞壁，使細(xì)胞中的多糖及黃酮較大程度地同步溶出，即可達(dá)到同步高效提取多糖和黃酮的目的。

本研究采用微生物發(fā)酵技術(shù)對青錢柳多糖和黃酮進(jìn)行同步提取，優(yōu)化提取工藝，以得到一種經(jīng)濟(jì)有效、同步快速提取青錢柳多糖和黃酮的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳葉，采自江西修水縣；纖維素酶(酶活力100 000 U/g)、半纖維素(酶活力50 000 U/g)，和氏璧生物科技有限公司；黑曲霉 CICC 2041、枯草芽孢桿菌 CICC 10023，由江西省食品發(fā)酵研究所微生物實(shí)驗(yàn)室提供；蘆丁(99.8%)、葡萄糖(99.6%)，北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇、石油醚、無水乙醇、苯酚、硫酸，西隴化工股份有限公司；AlCl3(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756PC紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；ML204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司；QYC-2102搖床，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZF-75KB高壓滅菌鍋、GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取工藝

青錢柳葉干燥、粉碎→酶解→高溫滅菌→接種→發(fā)酵提取→過濾→測定

↑ ↑

纖維素酶、半纖維素酶 黑曲霉、枯草芽孢桿菌

1.3.2 菌種活化

將黑曲霉接入馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min 培養(yǎng)36 h制成黑曲霉種子液；將枯草芽孢桿菌接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃、150 r/min培養(yǎng)18 h，制成枯草芽孢桿菌種子液。

1.3.3 青錢柳多糖和黃酮同步提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 料液比的選擇

稱取適量青錢柳葉粉末，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL)添加水，然后加入0.4%纖維素-半纖維素酶(2∶1，m/m)復(fù)合酶，于55 ℃水浴加熱酶解3 h后添加6%蔗糖，繼而115 ℃滅菌20 min，冷卻后以4%接種量接入菌種比為1∶3的黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，于150 r/min、30 ℃發(fā)酵提取1.5 d。測定發(fā)酵液中多糖及黃酮提取率，以確定最佳料液比。

1.3.3.2 酶添加量的選擇

在最佳料液比條件下，分別添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的復(fù)合酶酶解青錢柳葉，其他條件保持不變，發(fā)酵提取多糖和黃酮，測定發(fā)酵液中多糖及黃酮提取率，確定復(fù)合酶添加量。

1.3.3.3 菌種比例的選擇

選擇最佳料液比和酶添加量，其他條件不變，分別考察黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合比為1∶1、1∶2、1∶3、3∶1、2∶1對青錢柳葉發(fā)酵提取多糖和黃酮的影響，確定菌種比例。

1.3.3.4 接種量的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，分別以3%、4%、5%、6%、7%的接種量接入黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，于150 r/min、30 ℃發(fā)酵提取1.5 d。測定發(fā)酵液中多糖及黃酮提取率，確定接種量。

1.3.3.5 轉(zhuǎn)數(shù)的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，以4%接種量接入黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，分別以130、140、150、160、170 r/min于30 ℃發(fā)酵提取1.5 d。測定發(fā)酵液中多糖及黃酮提取率，確定轉(zhuǎn)數(shù)。

1.3.3.6 溫度的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，以4%接種量接入混合菌種子液，分別在22、26、30、34、38 ℃溫度下以150 r/min發(fā)酵提取1.5 d。測定發(fā)酵液中多糖及黃酮提取率，確定發(fā)酵溫度。

1.3.3.7 時(shí)間的選擇

選擇最佳料液比、酶添加量及菌種比例，以4%接種量接入混合菌種子液，于150 r/min、30 ℃分別發(fā)酵提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 d。測定發(fā)酵液中多糖及黃酮提取率，確定發(fā)酵時(shí)間。

1.3.3.8 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對青錢柳多糖及黃酮提取率影響較大的接種量、溫度和時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以多糖和黃酮的提取率為指標(biāo)，得到優(yōu)化的同步提取工藝。因素水平如表1。

1.3.4 多糖和黃酮提取率的測定

多糖采用苯酚-硫酸法測定[13-15]；黃酮采用紫外分光光度法測定[16-17]。

(1)

(2)

表1 青錢柳多糖和黃酮同步提取因素水平表Table 1 Factors and levels of the synchronous extractingCyclocarya paliurus polysaccharides and flavonoids

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值，并采用DPS v6.55和Excel 2007 軟件處理分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對多糖和黃酮提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增大，多糖和黃酮的提取率均隨之增加，這是由于隨著料液比增大，物料與溶液間的濃度差增大[18]，同時(shí)微生物的發(fā)酵作用也增強(qiáng)，使得青錢柳葉中的多糖和黃酮更易溶出。當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，兩者的提取率達(dá)到最大，繼續(xù)增大料液比，提取率基本趨于穩(wěn)定。故選擇1∶20為最佳料液比。

圖1 料液比對多糖和黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ratio of solid and liquid on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.2 酶添加量對多糖和黃酮提取率的影響

由圖2可知，當(dāng)酶添加量為0.4%時(shí)，青錢柳多糖和黃酮的提取率達(dá)到最高，分別為5.03%和4.67%，繼續(xù)增大酶添加量，提取率基本無變化，說明0.4%的酶量足以酶解青錢柳葉的細(xì)胞壁，使多糖和黃酮溶出。故最佳的酶添加量為0.4%。

圖2 酶添加量對多糖和黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.3 菌種比例對多糖和黃酮提取率的影響

不同的菌種比例對青錢柳多糖及黃酮的發(fā)酵提取效果不同，由圖3可知，黑曲霉與枯草芽孢桿菌的比例為1∶2時(shí)，多糖及黃酮的提取率最高，分別達(dá)5.28%和5.04%，說明此比例下兩種菌通過發(fā)酵作用對青錢柳葉細(xì)胞壁的破壞作用最強(qiáng)，最有利于多糖和黃酮的溶出。故最適的菌種比為1∶2。

圖3 菌種比例對多糖和黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of the ratio of strain on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.4 接種量對多糖和黃酮提取率的影響

由圖4可知，接種量低于5%時(shí)，多糖及黃酮的提取率隨著接種量的增加而增加，這是由于接種量加大，微生物增長較快，發(fā)酵提取時(shí)間減短，多糖和黃酮隨著微生物的發(fā)酵從青錢柳葉中溶出。接種量為5%時(shí)，提取率達(dá)到最大，分別為5.92%和6.11%，但繼續(xù)增大接種量，兩種物質(zhì)的提取率均下降，可能是由于微生物數(shù)量過多，導(dǎo)致多糖和黃酮被分解利用，使得含量減少[19]。故最佳接種量為5%。

圖4 接種量對多糖和黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of inoculation size on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.5 轉(zhuǎn)速對多糖和黃酮提取率的影響

不同的轉(zhuǎn)速對青錢柳發(fā)酵提取多糖和黃酮的效果不同，由圖5可知，隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速的增大，多糖和黃酮的提取率先增加后減少，轉(zhuǎn)速為160 r/min時(shí)，兩種物質(zhì)的提取率最高，分別為5.57%和5.21%。轉(zhuǎn)速大于160 r/min時(shí)，由于轉(zhuǎn)速過大，剪切力大，易導(dǎo)致微生物細(xì)胞破裂死亡，不利于菌體的生長代謝，使得對青錢柳葉的發(fā)酵作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致多糖和黃酮的提取率降低。故最適轉(zhuǎn)速為160 r/min。

圖5 轉(zhuǎn)速對多糖和黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of shaking speed on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.6 溫度對多糖和黃酮提取率的影響

溫度對微生物的生長代謝有重要影響，它會(huì)影響菌體細(xì)胞內(nèi)酶的活性及蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成[20]，從而影響青錢柳多糖及黃酮的發(fā)酵提取產(chǎn)量。

圖6 溫度對多糖和黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

由圖6可知，多糖和黃酮的提取率隨著發(fā)酵溫度的升高而先增加后降低，30 ℃時(shí)兩種物質(zhì)的提取率達(dá)到最高。溫度過低，黑曲霉和枯草芽孢桿菌生長緩慢，溫度過高，黑曲霉活性降低，生長代謝能力下降，因此過高或過低的溫度均不利于微生物的發(fā)酵作用，故最佳溫度定為30 ℃。

2.7 時(shí)間對多糖和黃酮提取率的影響

由圖7可知，發(fā)酵時(shí)間對多糖和黃酮的提取率影響較大，發(fā)酵2 d，多糖及黃酮的提取率最高，分別達(dá)6.17%和6.09%。低于2 d時(shí)，2種物質(zhì)的提取率均隨著時(shí)間的增加而增加，這是由于多糖和黃酮隨著微生物的發(fā)酵而逐漸被溶出，繼續(xù)延長發(fā)酵時(shí)間，兩種物質(zhì)的提取率反而下降，可能是由于發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)被耗盡導(dǎo)致菌種的發(fā)酵能力減弱，以及已溶出的多糖和黃酮被分解利用。因此最佳的發(fā)酵時(shí)間為2 d。

圖7 發(fā)酵時(shí)間對多糖和黃酮提取率的影響Fig.7 Effect of time on the extraction yield of polysaccharides and flavonoids

2.8 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

對正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，多糖提取率方差分析結(jié)果見表3，黃酮提取率方差分析結(jié)果見表4。

表2 正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

由表2極差分析結(jié)果可知，影響多糖提取率的主次因素依次為接種量>時(shí)間>溫度，影響黃酮提取率的主次因素依次為溫度>接種量>時(shí)間，通過直觀分析初步得到對于多糖的提取率而言較佳方案為A2B3C2，對于黃酮的提取率而言較佳方案為A2B2C2。

表3 多糖提取率方差分析結(jié)果
Table 3 Variance analysis of polysaccharides extractionyield

變異來源平方和自由度圴方F值P值顯著性A(接種量)2.699821.349967.456 40.014 6?B(溫度)0.396420.19829.905 10.091 7C(時(shí)間)1.146320.573128.641 30.033 7?誤差0.040020.0200

注：**表示P<0.01，差異極顯著；*表示0.01

表4 黃酮提取率方差分析結(jié)果
Table 4 Variance analysis of flavonoids extraction yield

變異來源平方和自由度圴方F值P值顯著性A(接種量)0.925 120.462 522.961 40.041 7?B(溫度)1.470 420.735 236.497 00.026 7?C(時(shí)間)0.035120.0175 00.870 90.534 5誤差0.040 320.020 1

由表3和表4方差分析結(jié)果可知，接種量對青錢柳多糖及黃酮提取率的影響均顯著，溫度對多糖提取率的影響不顯著，而對黃酮提取率的影響顯著，發(fā)酵時(shí)間對多糖提取率的影響顯著，而對黃酮提取率的影響不顯著。故綜合考慮多糖及黃酮提取率的極差分析和方差分析結(jié)果，可得出多糖及黃酮同步提取的最佳方案為A2B2C2。經(jīng)驗(yàn)證采用此方案發(fā)酵提取青錢柳多糖和黃酮，兩種物質(zhì)的提取率分別達(dá)7.57%和6.98%，因此青錢柳多糖及黃酮同步提取的最佳工藝為接種量5.0%、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間2 d。

3 結(jié)論

采用微生物發(fā)酵技術(shù)對青錢柳多糖和黃酮進(jìn)行同步提取，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化了多糖和黃酮的同步提取工藝，得到最佳提取工藝為：青錢柳葉以1∶20的料液比與水混勻，添加0.4%的纖維素酶-半纖維素酶復(fù)合酶進(jìn)行酶解，再按照5.0%接種量接入菌種比為1∶2的黑曲霉與枯草芽孢桿菌混合種子液，于160 r/min、30 ℃發(fā)酵提取2 d，最終得到青錢柳多糖的提取率達(dá)7.57%，黃酮的提取率達(dá)6.98%，遠(yuǎn)高于XIE等[21]采用超聲波提取法提取青錢柳多糖(得率為4.91%)和郝翻[22]采用有機(jī)溶劑提取法提取青錢柳黃酮(得率為3.055%)，極大提高了青錢柳多糖和黃酮的提取率及原料的利用率。