蔡文，曾偉主，周景文

(國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122)

2-酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconicacid，2-KGA)是一種重要的有機(jī)酸，用途廣泛[1]，能夠作為食品添加劑、水泥增塑劑、洗滌劑和照片顯影劑，最主要的用途是作為食品添加劑D-異抗壞血酸及其鈉鹽的前體[2]。此外，2-KGA還可以在2-酮基-D-葡萄糖酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-KDG)，2,5-KDG通過(guò)2,5-KDG還原酶可以生成用于維生素C合成的前體2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)[3]。2-KGA主要以化學(xué)法、酶催化法以及發(fā)酵法生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法以Pt/Pb為催化劑，催化D-葡萄糖與分子氧反應(yīng)形成2-KGA；酶法是指在相關(guān)氧化酶的催化作用下，將溶液中的D-葡萄糖經(jīng)多步氧化形成2-KGA；發(fā)酵法是通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵直接將D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為2-KGA，當(dāng)前，普遍應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)2-KGA的方法為細(xì)菌發(fā)酵法。主要的細(xì)菌有熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、球狀節(jié)桿菌、產(chǎn)酮產(chǎn)堿菌、巴氏醋酸桿菌、氧化葡萄糖酸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌等[4-7]。我國(guó)的工業(yè)生產(chǎn)以熒光假單胞菌為主，在以18%的葡萄糖溶液為底物時(shí)，最終的轉(zhuǎn)化率可達(dá)90.0%。但是熒光假單胞菌作為生產(chǎn)菌株，存在生產(chǎn)過(guò)程噬菌體污染、高濃度底物對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)的抑制和發(fā)酵液中成分過(guò)多，分離困難等問(wèn)題。

本研究中采用的菌株為氧化葡萄糖酸桿菌[8]，具有耐高滲、耐酸等特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)葡萄糖的利用率較高，因此可以用作生產(chǎn)2-KGA的菌株。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)5株野生菌進(jìn)行初步篩選，針對(duì)具有較強(qiáng)2-KGA積累能力的菌株進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，包括搖瓶培養(yǎng)的溫度、培養(yǎng)基的組成以提高2-KGA的產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

GluconobactercerinusCGMCC 1.110[9]、Glucono-bacterjaponicusCGMCC 1.49[10]：中國(guó)普通微生物菌株保藏中心；Gluconobacteroxydans621H[11]：美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；GluconobacteroxydansWSH-003[12]：江蘇江山制藥有限公司；GluconobacteroxydansT-100：日本NBRC菌株保藏中心。

1.1.2 主要試劑

頭孢西丁鈉鹽、卡納霉素抗生素，阿拉丁生物；蛋白胨、酵母粉，Oxoid生物。其他常規(guī)試劑購(gòu)自國(guó)藥試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物10，山梨醇50，相應(yīng)的固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂條，115 ℃滅菌20 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿粉20，CaCO320，MgSO40.2，(NH4)2SO42，KH2PO40.5，115 ℃滅菌20 min。

3 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿粉20，CaCO30.1,MgSO40.2,(NH4)2SO42，KH2PO40.5，115 ℃滅菌20 min。

1.1.4 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司；高壓蒸汽滅菌鍋,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；恒溫?fù)u床,上海知楚儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子活化

從冰箱中取出保存的菌株甘油管解凍后，用接種針蘸取菌液劃線于平板上，放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑取平板上的單菌落于裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，放置于30 ℃恒溫?fù)u床中，220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

搖瓶培養(yǎng)：將活化后的種子液以10%接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為50 mL的500 mL搖瓶中，30 ℃下220 r/min培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：以10%接種量將培養(yǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接到3 L發(fā)酵罐中，裝液量為1 L，攪拌轉(zhuǎn)速600 r/min，通氣量4 vvm，30 ℃下培養(yǎng)。

1.2.3 檢測(cè)方法

采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定發(fā)酵液中的2-KGA含量。利用AMINEX HPX-87H有機(jī)酸柱進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：流動(dòng)相0.5 mmol/L稀H2SO4溶液，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將購(gòu)買(mǎi)的標(biāo)準(zhǔn)品溶于純水中，按照一定比例稀釋成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液后，以液相檢測(cè)的峰面積為Y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到液相檢測(cè)的峰面積與產(chǎn)物濃度的關(guān)系。

1.2.4 最終轉(zhuǎn)化率計(jì)算

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)2-KGA菌株篩選

本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株共5株:G.cerinusCGMCC 1.110、G.japonicusCGMCC 1.49、G.oxydans621H、G.oxydansWSH-003 和G.oxydansT-100。分別以這5株野生菌作為出發(fā)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L的培養(yǎng)基為底物發(fā)酵，催化生產(chǎn)2-KGA。通過(guò)液相色譜檢測(cè)產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比，篩選出1株高產(chǎn)菌株作為后續(xù)發(fā)酵優(yōu)化的出發(fā)菌株。從圖1可以看出，在這5株野生菌中，G.japonicusCGMCC 1.49的產(chǎn)量最高，為19.9 g/L，轉(zhuǎn)化率為36.9%，將其作為后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

A-G. oxydans WSH-003；B- G. oxydans 621H；C-G. japonicusCGMCC 1.49；D-G. cerinus CGMCC 1.110；E-G. oxydans T-100圖1 五株出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)量對(duì)比Fig.1 Comparison of 2-KGA titer of 5 starting strains

2.2 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響

氧化葡萄糖酸桿菌中含有較多的脫氫酶，不同的底物可以被特異性催化生成不同的代謝產(chǎn)物[13]。以葡萄糖為底物時(shí)，產(chǎn)物為酮基葡萄糖酸，包括2-KGA和5-酮基葡萄糖酸(5-KGA)以及2,5-二酮基-D-葡萄糖酸(2,5-KDG)[14]。本實(shí)驗(yàn)中，確定以葡萄糖作為底物，探究不同濃度的底物對(duì)發(fā)酵以及產(chǎn)率的影響。

A-不同底物濃度對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)曲線；B-不同底物濃度條件下的2-KGA產(chǎn)量圖2 葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.2 Effects of glucose concentrations on fermentation process

從圖2和表1中可以看出，培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度不同，對(duì)于發(fā)酵過(guò)程中菌體的生長(zhǎng)量、生長(zhǎng)速率和2-KGA的產(chǎn)量有一定影響。當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L和100 g/L時(shí)，菌體的生長(zhǎng)速度較快，最大的OD600值分別為12.5和13.7，可以看出當(dāng)葡萄糖初始濃度較小時(shí)，有利于菌體的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速率較快；濃度較高時(shí)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)有較大的抑制作用，導(dǎo)致最終的菌體量較小。綜合考慮菌體的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)量以及轉(zhuǎn)化率，選取底物質(zhì)量濃度為100 g/L作為發(fā)酵的初始濃度。

表1 初始葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵的影響Table 1 Effect of initial glucose concentration onfermentation process

2.2.2 氮源種類(lèi)以及最優(yōu)氮源濃度對(duì)發(fā)酵的影響

本實(shí)驗(yàn)選取的氮源有硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、尿素、玉米漿粉、酵母粉和牛肉浸膏，添加量均為10 g/L，發(fā)酵72 h后，對(duì)比2-KGA的產(chǎn)量，確定最佳氮源[15]。從圖2-A中得出，以玉米漿粉作為氮源時(shí)，對(duì)比生長(zhǎng)情況在各個(gè)氮源種類(lèi)中最佳，發(fā)酵72 h后，2-KGA產(chǎn)量為23.8 g/L，轉(zhuǎn)化率為44.2%。在所選氮源中，最終的產(chǎn)率最高。

在確定最佳的氮源為玉米漿粉后，對(duì)玉米漿粉添加量進(jìn)行優(yōu)化。選取5個(gè)濃度梯度進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。不同玉米漿粉質(zhì)量濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成都有一定的影響，通過(guò)圖3-B中比較可以得出玉米漿粉的最優(yōu)添加量為20 g/L。

A-不同氮源對(duì)2-KGA產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響；B-玉米漿粉添加量對(duì)2-KGA產(chǎn)量及菌體生長(zhǎng)的影響圖3 氮源及最佳氮源添加量對(duì)2-KGA的產(chǎn)量以及菌體生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources and optimum nitrogen sources on titer of 2-KGA and growth of strain

2.2.3 溫度對(duì)發(fā)酵的影響

氧化葡萄糖酸桿菌中已知的相關(guān)酶類(lèi)的性質(zhì)，主要涉及的葡萄糖脫氫酶和葡萄糖酸-2-脫氫酶最適溫度與菌體生長(zhǎng)的最適溫度有差別，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同溫度條件下的發(fā)酵情況進(jìn)行比較[13,16-17]。主要控制發(fā)酵溫度在28～32 ℃范圍內(nèi)，以50 g/L底物質(zhì)量濃度發(fā)酵，控制其他條件相同，比較菌體的生長(zhǎng)和最終產(chǎn)率情況。從圖4可以得出，同一批次中，當(dāng)控制發(fā)酵溫度在30 ℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)速度較快，發(fā)酵至終點(diǎn)的菌體量及最終的產(chǎn)率最高，產(chǎn)量達(dá)到23.7 g/L，轉(zhuǎn)化率為49.6%。

A-溫度對(duì)2-KGA產(chǎn)量的影響；B-不同溫條件下的生長(zhǎng)曲線圖4 溫度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.4 Effects of temperature on fermentation process

2.3 3 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)

2.3.1 初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響

通過(guò)在搖瓶上對(duì)發(fā)酵條件的摸索，確定培養(yǎng)基的基本組成，在發(fā)酵罐中對(duì)搖瓶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行放大[1,18]。在摸索搖瓶發(fā)酵條件時(shí)，對(duì)pH值條件的摸索受到限制，主要通過(guò)碳酸鈣的添加來(lái)維持搖瓶中的pH值，在發(fā)酵罐上主要采用50%的氨水溶液進(jìn)行pH值的調(diào)節(jié)。在搖瓶上進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，對(duì)比不添加碳酸鈣進(jìn)行發(fā)酵，最終的發(fā)酵液的pH值僅為2.8左右，且檢測(cè)不到產(chǎn)物。所以猜想，在發(fā)酵過(guò)程中如果pH值一直維持較低水平，不利于產(chǎn)物的產(chǎn)生。當(dāng)初始pH值為4.0或更低時(shí)，菌體的生長(zhǎng)受到了很大抑制，所以需要在發(fā)酵罐上對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的pH值進(jìn)行調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)主要選取了pH值為5.0、6.0、7.0進(jìn)行對(duì)比。

對(duì)比圖5不同pH條件下的發(fā)酵情況發(fā)現(xiàn)，當(dāng)控制發(fā)酵過(guò)程中的pH值為6.0，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到60 h時(shí)，產(chǎn)量最高達(dá)到93.4 g/L，轉(zhuǎn)化率為87.2%。在該條件下，菌體的生長(zhǎng)狀況最好，所以在后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，控制pH值為6.0。從葡萄糖消耗速率與中間產(chǎn)物葡萄糖酸的產(chǎn)生速率來(lái)看，前24 h內(nèi)，底物被快速消耗，大部分轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物葡萄糖酸，菌體持續(xù)快速生長(zhǎng)。經(jīng)歷了前24 h后，菌體量保持增加，底物逐漸消耗盡，中間產(chǎn)物開(kāi)始轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物2-KGA。另外檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中溶氧發(fā)現(xiàn)，在0～36 h內(nèi)變化劇烈且出現(xiàn)最低值，說(shuō)明此階段菌體生長(zhǎng)旺盛，耗氧量增加。36 h后，溶氧開(kāi)始慢慢上升，發(fā)酵持續(xù)到42 h后，溶氧水平保持平衡，菌體生長(zhǎng)開(kāi)始放緩。后續(xù)發(fā)酵罐上的溶氧水平優(yōu)化可以此作為參考。

圖5 pH對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.5 Effects of pH on fermentation process

2.3.2 溶氧對(duì)發(fā)酵的影響

溶氧(DO)是好氧微生物生長(zhǎng)所必須的條件，更是對(duì)產(chǎn)物生成和能量代謝產(chǎn)生影響的關(guān)鍵環(huán)境因素之一。溶氧作為發(fā)酵過(guò)程中的重要參數(shù)，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本具有重大影響。在研究確定了最佳的pH值后，繼續(xù)對(duì)溶氧進(jìn)行探究。通過(guò)前期對(duì)罐上發(fā)酵過(guò)程的溶氧水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)可知，在接種后的0～24 h內(nèi)，溶氧量劇烈波動(dòng)不斷下降，最低降為0且維持一段時(shí)間；在36 h后，溶氧水平慢慢回升至最高值后維持恒定。所以本實(shí)驗(yàn)中對(duì)發(fā)酵前36 h內(nèi)控制溶氧條件分別為20%、30%、40%和50%由圖6可知，隨著DO的升高，菌體生物量逐漸升高，至DO為40%時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)DO上升至50%時(shí)，菌體的生長(zhǎng)量反而減小，同時(shí)當(dāng)控制DO為30%時(shí)，2-KGA產(chǎn)量達(dá)到最大，且此條件下的產(chǎn)率也達(dá)到最高，分別為97.3 g/L和90.3%。雖然氧化葡萄糖酸桿菌是好氧菌，但是過(guò)多的氧氣容易引起超氧化物和羥基自由基等物質(zhì)形成，破壞細(xì)胞的組成，從而對(duì)菌體自身的代謝產(chǎn)生影響。

圖6 不同DO水平對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響Fig.6 Effects of different DO levels on fermentation process

2.3.3 一次性補(bǔ)料時(shí)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度對(duì)發(fā)酵的影響

本實(shí)驗(yàn)采用3 L自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行2-KGA的分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，初始的葡萄糖質(zhì)量濃度均為100 g/L，裝液量為1 L。發(fā)酵過(guò)程中以發(fā)酵液中的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為指標(biāo)，分別選取殘?zhí)琴|(zhì)量濃度降低至15、25、35和45 g/L四個(gè)水平，一次性補(bǔ)加葡萄糖250 g/L，補(bǔ)糖量為200 mL，再以同樣的條件發(fā)酵至終點(diǎn)。在發(fā)酵開(kāi)始后10～18 h內(nèi)，每1 h取樣1次，監(jiān)測(cè)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度，確定補(bǔ)料時(shí)機(jī)，補(bǔ)料之后每6 h取樣1次。

殘?zhí)琴|(zhì)量濃度分別為：A-15 g/L;B-25 g/L;C-35 g/L;D-45 g/L圖7 殘?zhí)琴|(zhì)量濃度對(duì)生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effect of residual sugar concentration on growth

由圖7可知，在不同的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度下，一次性添加50 g葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵，有利于減弱底物抑制，避免快速利用碳源的阻遏效應(yīng)；補(bǔ)料發(fā)酵還可以控制最佳的生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成條件，穩(wěn)定生產(chǎn)工藝。在25 g/L和45 g/L時(shí)一次性補(bǔ)料，菌體生長(zhǎng)較旺盛，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期比生長(zhǎng)速率較快，且能獲得較高的菌體濃度。結(jié)合在發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖消耗、中間產(chǎn)物以及2-KGA生成的速率分析，在殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為35 g/L和45 g/L時(shí)一次性補(bǔ)料后底物的消耗以及產(chǎn)物的形成速率較快。殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為35 g/L時(shí)一次性補(bǔ)料，最大的生產(chǎn)強(qiáng)度為4.33 g/(L·h)，發(fā)酵92 h后產(chǎn)量最終達(dá)到112.1 g/L；而殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為45 g/L時(shí)，最大的生產(chǎn)強(qiáng)度為6.16 g/(L·h)，發(fā)酵92 h后產(chǎn)量最終達(dá)到122.1 g/L。同時(shí)，當(dāng)選擇殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為45 g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，最終發(fā)酵液中殘留的葡萄糖酸最少，給后期產(chǎn)物提純帶來(lái)的影響較小。在15 g/L和25 g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，菌體生長(zhǎng)較慢，2-KGA產(chǎn)量較低，生產(chǎn)強(qiáng)度和底物利用率不高。綜合產(chǎn)物得率以及轉(zhuǎn)換率對(duì)比得出，在殘?zhí)琴|(zhì)量濃度為45 g/L時(shí)一次性補(bǔ)料后，菌體生長(zhǎng)較好，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度最高，分別為75.5%和6.16 g/(L·h)，產(chǎn)量較分批發(fā)酵提高了43.5%。

3 討論

本文從5株菌中篩選出最適菌株G.japonicusCGMCC 1.49，并對(duì)其產(chǎn)2-KGA的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，在此最適條件下，2-KGA搖瓶發(fā)酵最高產(chǎn)量為76.3 g/L，較優(yōu)化前提高了120.0%。對(duì)3 L罐中生產(chǎn)2-KGA的最優(yōu)pH值和溶氧條件進(jìn)行探究，得到在pH值為6，DO為30%條件下，2-KGA的產(chǎn)量為97.3 g/L，較搖瓶最高水平提高了26.7%。通過(guò)一次性補(bǔ)料優(yōu)化后，產(chǎn)量達(dá)到122.1 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)75.5%。在后期的研究中，可以通過(guò)對(duì)補(bǔ)料方式和補(bǔ)料時(shí)機(jī)進(jìn)一步探究，完善氧化葡萄糖酸桿菌產(chǎn)2-KGA過(guò)程中的各項(xiàng)參數(shù)，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)2-KGA的目標(biāo)。本文篩選最適菌株后主要通過(guò)發(fā)酵優(yōu)化手段實(shí)現(xiàn)2-KGA的高產(chǎn)，沒(méi)有對(duì)其進(jìn)行分子改造。最終結(jié)果表明，潛在副產(chǎn)物5-KGA和2,5-DKG的含量極低，對(duì)后期的分離提純影響較小。近年來(lái)，對(duì)氧化葡萄糖酸桿菌的基因操作手段日趨完善[13,19-21]。在后續(xù)工作中，通過(guò)代謝工程策略強(qiáng)化2-KGA合成的關(guān)鍵酶、優(yōu)化補(bǔ)料發(fā)酵條件，將有望進(jìn)一步提升2-KGA產(chǎn)量[22-23]。本研究為后續(xù)利用氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2-KGA，及利用代謝工程改造實(shí)現(xiàn)維生素C前體2-KLG的直接發(fā)酵提供理論與技術(shù)參考[24-25]。