劉春瑩，胡善松，張慶芳，李美玉，于爽，遲乃玉*

1(大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連，116622) 2(遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連，116622)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOD)的系統(tǒng)名稱為β-D-葡萄糖氧化還原酶(E.C.1.1.3.4)[1]，最先于1904年在黑曲霉和灰綠青霉中發(fā)現(xiàn)[2-4]。它能夠催化β-D-葡萄糖被氧化成葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯，進(jìn)而被水解成葡萄糖酸，并生成過氧化氫[5]。因此，GOD因其具有脫氧和防腐的功能，而應(yīng)用在食品保鮮方面。GOD還具有消除腸道病原菌、解除腸道霉菌毒素中毒、改善腸道酸性消化環(huán)境、保護(hù)腸道上皮完整的功能[6-7]，被廣泛應(yīng)用在畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)[8-9]。由于GOD的專一氧化葡萄糖的特性，在生物傳感器、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域是重要分析用酶[10-13]。

野生菌株中GOD活力較低，利用基因工程進(jìn)行改造成為一種有效的手段。20世紀(jì)KOVACEVIC等[14]與GUO等[15]在畢赤酵母中成功表達(dá)黑曲霉GOD。PULCI等[16]也將青霉GOD的基因成功克隆到酵母中并實(shí)現(xiàn)表達(dá)。隨著GOD需求的增加，我國相關(guān)研究也逐漸增多。周亞鳳等[17]將黑曲霉GOD基因克隆到酵母中并高效表達(dá)。高慶華等[18]也將青霉GOD基因克隆到酵母中并表達(dá)。大腸桿菌一直作為外源蛋白表達(dá)的首選系統(tǒng)[19]，但很少應(yīng)用在GOD外源表達(dá)方面?，F(xiàn)有報(bào)道僅WITT等[20]及顧磊等[21]嘗試在大腸桿菌中表達(dá)黑曲霉GOD。細(xì)菌與大腸桿菌的同源性更高，可能更適合在大腸桿菌中表達(dá)，但此類的研究此前未見報(bào)道。

本研究以海洋細(xì)菌Citrobacterssp. 8-III為出發(fā)菌株,采用E.coliBL21(DE3)為表達(dá)宿主，構(gòu)建GOD高產(chǎn)大腸桿菌工程菌株，實(shí)現(xiàn)GOD在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并對重組GOD酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

Citrobacterssp. 8-III：遼寧省海洋微生物工程中心提供(分離自大連渤海海域，深度約30 m的海泥中。)；E.coliDH5ɑ：構(gòu)建和克隆目的基因；E.coliBL21(DE3)：表達(dá)宿主；質(zhì)粒pMD9-T：克隆載體；質(zhì)粒pET-28a(+)：表達(dá)載體。

1.1.2 試劑與儀器

PCR相關(guān)試劑、克隆相關(guān)試劑和限制性內(nèi)切酶：Takara公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒等：上海生工生物有限公司；瓊脂糖、辣根過氧化物酶和鄰聯(lián)茴香胺等試劑：Sigma公司。

PCR儀和電轉(zhuǎn)化儀，Eppendorf公司；Multiskan1510酶標(biāo)儀，Thermo Fisher Scientific；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱，上海愛郎儀器有限公司；HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HD-1360 超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AL-204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；RDY-SP1Z型核酸電泳儀，北京榮陽靜電科技有限公司

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨；種子培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨、5 g/L牛肉膏、10 g/L NaCl；發(fā)酵培養(yǎng)基：60 g/L葡萄糖、3 g/L蛋白胨、2 g/L K2HPO4、0.7 g/L MgSO4、0.5 g/L KCl、4 g/L NaNO3，pH 6.5。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株8-III GOD基因的獲取

挑取菌株8-III的單菌落于8 mL種子培養(yǎng)基,于25 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，以2%的接種量接種到含有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，160 r/min，25 ℃搖床中培養(yǎng)48 h。取2 mL的菌液于8 000 r/min離心，去掉上清液，用PBS洗滌2次，再次離心收集菌體。利用基因組大量提取試劑盒(powermax TMSoil DNA isolation kit)提取基因組DNA。所提DNA送到北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行DNA質(zhì)量檢測，并使用Illumina Hiseq X10高通量測序平臺進(jìn)行雙端測序(PE150)，得基因組草圖。對測序數(shù)據(jù)過濾低質(zhì)量后，利用Velvet軟件[18]進(jìn)行初步組裝，得到最終基因組框架圖(draft genome)。根據(jù)GenBank公布GOD基因序列通過BLAST比對確定目的基因。交由Synbio Technologies公司對8-III菌株的GOD基因進(jìn)行基因全長合成，并構(gòu)建于克隆載體pMD-9-T，命名pMD-9-T-GOD。

1.2.2 目的基因的克隆

5′端引物序列P1為：5′-ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA-3′，其3′端引物序列P2為：5′-CTAGGCACTTTTGGCA-TAGTCTTCA-3′，用這對引物以pMD-9-T-GOD為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：基因組DNA 100 ng，引物各0.2 μmol/L，dNTPs 250 μmol/L，5×Q5高保真DNA聚合酶緩沖液10 μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃、5 min；98 ℃、 30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定純度和分子量的大小。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒回收。

1.2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將pET-28a(+)用NcoⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，與目的基因連接，重組質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-GOD。該表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方式刪除了pET-28a(+)質(zhì)粒載體上的全部標(biāo)簽，可用來構(gòu)建無標(biāo)簽的基因表達(dá)工程菌。將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，陽性的轉(zhuǎn)化菌命名為E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-GOD。送至Synbio Technologies公司測序驗(yàn)證，保存測序正確的菌株。

1.2.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將E.coliBL21/pET-28a(+)-GOD接種于10 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，160 r/min，25 ℃，過夜培養(yǎng)。取上述菌液按2%接種量接種于100 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，160 r/min，25 ℃培養(yǎng)4 h，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。收集菌體發(fā)酵液于10 000 r/min，4 ℃，離心20 min，棄上清。菌體沉淀以pH 7.4的PBS洗滌，重復(fù)洗滌3次。洗滌后用10 mL的PBS重懸。將重懸液超聲裂解15 min(開3 s，間隔5 s，功率200 W)。將裂解液以10 000 r/min，4 ℃，離心20 min，上清液為粗酶液。粗蛋白用Ni2+-NTA柱(Novagen)進(jìn)行親和層析純化，洗脫的蛋白液4 ℃保存，蛋白樣品經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，同時(shí)以空載體和未誘導(dǎo)作對照，記錄并分析結(jié)果。

1.2.5 酶活力測定[22]

于96孔板中依次加入5%葡萄糖溶液150 μL，鄰聯(lián)茴香胺溶液150 μL，辣根過氧化物酶溶液10 μL，25 ℃反應(yīng)10 min，加入待測液10 μL。酶標(biāo)儀波長460 nm，每間隔1 min測定1次，共測定5次。以在25 ℃，pH 6.5的磷酸緩沖溶液的反應(yīng)條件下，每分鐘將1 μmol的葡萄糖催化氧化為葡萄糖酸和過氧化氫所需要的GOD的量定義為1個(gè)GOD的活力單位。根據(jù)公式計(jì)算酶活[19]。

1.2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究

溫度對重組GOD影響：將適當(dāng)稀釋的酶液分別在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60和65 ℃下進(jìn)行反應(yīng)，以酶活最高者為100%計(jì)算相對酶活，從而確定該酶的最適作用溫度。將適當(dāng)稀釋的酶液分別放到0、10、20、30、40、50和60 ℃下保溫1 h，每隔30 min取樣，在冰上放置5 min后進(jìn)行酶活測定。以未進(jìn)行熱處理的酶液的酶活為100%計(jì)算相對酶活，確定重組GOD的熱穩(wěn)定性。

pH值對重組GOD影響：配制pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的PBS緩沖體系，將酶液分別用這些緩沖液稀釋后進(jìn)行反應(yīng)，以酶活最高者為100%計(jì)算相對酶活，從而確定GOD酶的最適pH值。分別將酶液在pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的PBS緩沖液中保溫30 min(溫度為25 ℃)，以未經(jīng)保溫處理的酶活為100%計(jì)算殘余酶活力，從而確定GOD酶的pH穩(wěn)定性。

金屬離子對酶活影響：在GOD酶與其底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中，加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Zn2+、Ba2+及乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，使其終濃度為0.35 mmol/L，然后按照1.2.5的方法進(jìn)行酶活測定。以不加金屬離子的反應(yīng)體系的酶活定義為100%，表示不同金屬離子或化合物下的相對酶活。

1.2.7 雞飼料的應(yīng)用

將重組GOD純化后與SiO2以4∶1比例復(fù)配后,以0.05%加入雞飼料中，喂養(yǎng)A組雛雞;只加入GOD未與SiO2復(fù)配的雞飼料喂養(yǎng)B組雛雞;以未加入GOD的雞飼料喂養(yǎng)C組雛雞。每組12只，喂養(yǎng)14 d，記錄平均每日增重、平均每日攝取量、飼料利用率和腹瀉率。

1.2.8 幼犬飼料保鮮

將重組GOD純化后與SiO2以4∶1比例復(fù)配后，以0.05%加入幼犬飼料中，為實(shí)驗(yàn)組A；以陸生霉菌GOD與SiO2以4∶1比例復(fù)配后，以0.05%加入幼犬飼料中，為實(shí)驗(yàn)組B；以未加入GOD的幼犬飼料為實(shí)驗(yàn)組C。每組50份0.5 kg飼料，4 ℃儲藏14 d，記錄飼料霉變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因PCR擴(kuò)增

以pMD-9-T-GOD為模板PCR擴(kuò)增GOD基因，見圖1。

M-DNA Marker；1～4-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 目的基因克隆PCR電泳檢測結(jié)果Fig.1 PCR assay of the targetgene

目的基因條帶單一、濃度較高。經(jīng)測序其全長為1 292 bp，提交至Genbank所獲序列登錄號是MK054202，與Genbank中其他GOD基因序列的相似度在92%～98%，預(yù)期能夠編碼含有428個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。對序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)序列中不含有內(nèi)含子和基因原有的信號肽序列，不含有SacⅠ、NotⅠ和SnabⅠ酶切位點(diǎn)，含有NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，符合之前的預(yù)測。

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

分別用NcoⅠ和XhoⅠ對pET-28a-GOD做分步酶切，預(yù)期得到大小分別為5.4 kb的載體片段和1.3 kb的目的基因片段。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果見圖2。泳道1為重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果，大小與預(yù)期結(jié)果一致，將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測序，最終確定重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-GOD。

M-DNA Marker；1-酶切處理的質(zhì)粒；2-質(zhì)粒DNA圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-GOD的酶切鑒定Fig.2 Restriction pattern of recombinant pET-28a-GOD

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將經(jīng)鑒定正確的原核重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a-GOD轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)。通過SDS-PAGE分析目標(biāo)蛋白表達(dá)情況。加入IPTG后成功誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)。以沒有裝載GOD的E.coliBL21/pET28a菌體作為對照，在E.coliBL21/pET28a-GOD菌體裂解液全菌、上清液和沉淀的約46 kDa位置出現(xiàn)一條蛋白帶(圖3)，該蛋白帶分子質(zhì)量與重組GOD的理論分子質(zhì)量(46 kDa)相一致，由此推測該蛋白帶為誘導(dǎo)表達(dá)的GOD。此外，由圖(圖3泳道2)可見菌體裂解后的可溶部分也檢測到GOD蛋白條帶，說明克隆菌株不僅能有效表達(dá)GOD，而且重組GOD為可溶性表達(dá)。

2.4 NI+-NTA柱親和純化

通過Ni+-NTA親和層析柱進(jìn)行GOD純化，SDS-PAGE檢測洗脫收集液，如圖4所示。目標(biāo)蛋白被150 mmol/L和200 mmol/L咪唑溶液洗脫下來，大小在46 kDa左右，且洗脫液中雜蛋白較少。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-E. coli BL21/pET28a-GOD菌體裂解液沉淀；2-E. coli BL21/pET28a-GOD菌體裂解液上清液；3-E. coli BL21/pET28a-GOD菌體裂解液全液；4-E. coli BL21/pET28a(+)菌體裂解液上清液圖3 目的蛋白GOD的SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE analysis of GOD protein

M-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-150 mmol/L咪唑溶液洗脫目標(biāo)蛋白；2-200 mmol/L咪唑溶液洗脫目標(biāo)蛋白圖4 純化后E. coli BL21/pET28a-GOD的SDS-PAGEFig.4 SDS-PAGE of E. coli BL21/pET28a-GOD after purification

2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.5.1 酶最適作用溫度

將重組GOD在10～60 ℃處理5 min，結(jié)果如圖5-a所示。酶的最適反應(yīng)溫度為25 ℃，20～35 ℃相對酶活可以保持在80%以上，40 ℃后相對酶活快速降低。此外該酶在0 ℃時(shí)可保持50%相對酶活，符合海洋細(xì)菌低溫酶特性，在較短的時(shí)間產(chǎn)生大量GOD。如圖5-b所示，10～35 ℃時(shí)，相對酶活可保持80%以上，表明在該溫度范圍內(nèi)酶的溫度穩(wěn)定性良好，其中25 ℃酶活最穩(wěn)定，相對酶活保持在90%以上，40 ℃后穩(wěn)定性迅速下降。該酶在0 ℃時(shí)可保持60%以上酶活力且穩(wěn)定性快速提升，10 ℃后可達(dá)到60%以上酶活力，說明該酶具有低溫酶特性，且溫度穩(wěn)定性良好。

a-酶最適作用溫度；b-酶的溫度穩(wěn)定性圖5 溫度對酶活影響Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity

2.5.2 酶最適作用pH

如圖6-a所示，重組GOD的最適pH值為6.0，在pH值為5.5～6.5時(shí)，保持85%以上的相對酶活，表明該酶屬于偏酸性GOD。如圖6-b所示，該酶在pH 6.5時(shí)穩(wěn)定性最好，在pH 6.0～7.0時(shí)相對酶活可保持80%以上，pH 7.5以后穩(wěn)定性快速降低。推測GOD中可能存在酸性基團(tuán)，堿性條件下不能穩(wěn)定存在。在pH 7.5以上會產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，影響酶活。

a-最適pH值; b-pH穩(wěn)定性圖6 pH對酶活影響Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

2.5.3 金屬離子及螯合劑對酶活的影響

由圖7可知，K+、Ni2+對重組GOD的活性有明顯促進(jìn)作用；Na+、Zn2+、Fe3+、Cu2+、Ag+、Ca2+、Fe2+、Mg2+和EDTA對GOD活性有抑制作用，其中Cu2+、Ag+、Ca2+、Fe2+和Mg2+嚴(yán)重抑制重組GOD酶活性。推測這可能是由于這些離子與酶中心的功能基團(tuán)結(jié)合，進(jìn)而引起酶失活。

圖7 金屬離子及螯合劑對酶活力的影響Fig.7 Effects of metalions and chelating agents on enzyme activity

2.6 雞飼料中應(yīng)用

將重組GOD添加到雞飼料中，飼養(yǎng)結(jié)果如表1所示。A組雛雞的平均日增和飼料利用率重要大大高于B、C兩組，其中B組又比C組要高。腹瀉率C組最高，A組最低。結(jié)果表明，重組GOD可以通過改善腸道菌群提升對飼料的有效吸收，從而提升雞體重。此外，重組GOD需要與相應(yīng)載體聯(lián)合使用，單獨(dú)使用重組GOD效果并不理想。

表1 重組GOD在雞飼料中應(yīng)用Table 1 Application of recombinant GOD in chicken feed

2.7 幼犬飼料中應(yīng)用

重組GOD添加到幼犬飼料中，結(jié)果如圖8所示。A組的霉變情況最好，C組最差，B組稍好于C組。說明重組GOD確實(shí)具備防腐的作用，并且在低溫環(huán)境也能有很好的作用，這是陸地來源GOD所不具備的。

圖8 幼犬飼料霉變情況Fig.8 Mildew of puppy feed

3 結(jié)論

GOD是一種重要的應(yīng)用酶，國內(nèi)外學(xué)者在其外源表達(dá)方面已進(jìn)行大量研究[22-26]。葡萄糖氧化酶最適作用溫度為40～45 ℃，在35～50 ℃酶活穩(wěn)定，屬于中高溫酶。本文首次嘗試將海洋細(xì)菌GOD基因在大腸桿菌中表達(dá)，并將酶活提升2.72倍。重組GOD分子質(zhì)量為46 kDa，在25 ℃，pH 6.5的環(huán)境下酶活最高，10～20 ℃酶活保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，重組GOD具備低溫酶特性，可以填補(bǔ)傳統(tǒng)陸地來源GOD在飼料保鮮等方面的不足。此外大腸桿菌可用于細(xì)菌GOD外源表達(dá)。同時(shí)，克隆菌株自身具有培養(yǎng)條件簡單經(jīng)濟(jì)、生長繁殖快速、蛋白表達(dá)水平高等優(yōu)勢、遺傳背景清晰、基因改造工具多樣等特點(diǎn)[15]，與工業(yè)生產(chǎn)相契合。

將重組GOD添加到動物飼料中，可起到防腐作用，并提升飼料利用率。重組GOD通過殺滅或抑制病原微生物的生長繁殖維持動物腸道菌群平衡，自身及代謝產(chǎn)物對動物和環(huán)境均無毒副作用，且不易誘發(fā)耐藥菌產(chǎn)生，也不易誘發(fā)交叉耐藥菌的產(chǎn)生，具備加工為飼料添加劑的潛力。此外，已報(bào)到的GOD飼料添加劑絕大多數(shù)自身不具備防腐功效[27-28]，重組GOD的低溫酶特性，可填補(bǔ)傳統(tǒng)GOD在低溫領(lǐng)域的空白。在食品保鮮與以低溫檢測方面有良好的應(yīng)用前景。