陸蘭芳，楊鵬，王展，汪卓琳，于博*

(1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053; 2.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023)

山奈酚(kaempferol)是一種黃酮類化合物，幾乎不溶于水，來(lái)源于姜科植物山奈的根、莖以及檀香科植物百蕊草的提取物。山奈酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、防治糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和骨質(zhì)疏松、保護(hù)神經(jīng)、肝臟和心肌以及抑制蛋白激酶活性等營(yíng)養(yǎng)保健功能[1-5]，在食品、藥品等領(lǐng)域有著非常廣闊的應(yīng)用前景；但是山奈酚幾乎不溶于水，這極大地限制了其應(yīng)用范圍。環(huán)糊精分子具有剛性錐形空腔結(jié)構(gòu)，外部親水、內(nèi)部疏水，能包合疏水性客體分子，起到提高溶解度和穩(wěn)定性的作用，基于主客體相互作用的環(huán)糊精分子微膠囊是一種提高疏水性生物活性分子溶解性和穩(wěn)定的可靠技術(shù)手段。采用相溶解度法，能夠研究難溶性客體分子在環(huán)糊精存在下的溶解度變化規(guī)律，并計(jì)算其穩(wěn)定常數(shù)，這在環(huán)糊精微膠囊領(lǐng)域研究日益廣泛[6-12]。本文采用相溶解度法系統(tǒng)地研究了常用的環(huán)糊精對(duì)山奈酚的包合作用、增溶作用以及包合過(guò)程中有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)的變化規(guī)律，以期為山奈酚的微膠囊化應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

α-環(huán)糊精(α-CD)、β-環(huán)糊精(β-CD)、γ-環(huán)糊精(γ-CD)、甲基-β-環(huán)糊精(M-β-CD)、2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)、麥芽糖基-β-環(huán)糊精(Mal-β-CD) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；山奈酚、磺丁基-β-環(huán)糊精(SBE-β-CD)、羥乙基-β-環(huán)糊精(HE-β-CD) 上海源葉生物科技有限公司；甲醇(分析純) 西隴科學(xué)股份有限公司。

AL204電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；UV-2600PC紫外可見光分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司；QYC-200全溫培養(yǎng)搖床 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；PGJ-10-AS(超)純水機(jī) 武漢品冠儀器設(shè)備有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取0.0286 g的山奈酚，用無(wú)水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，配得0.001 mol/L山奈酚母液，轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶置于冰箱中保存?zhèn)溆?。分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL的0.001 mol/L的山奈酚母液于7個(gè)10 mL的棕色離心管中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，配得1.0×10-5～7.0×10-5mol/L一系列濃度梯度的山奈酚溶液，以無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)367 nm處測(cè)定不同濃度山奈酚溶液的吸光度。以山奈酚的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度下的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 不同環(huán)糊精濃度下的山奈酚增溶試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取適量不同環(huán)糊精，用超純水溶解，混合均勻，分別配得0.01 mol/L的環(huán)糊精水溶液各100 mL。吸取濃度為0.01 mol/L的環(huán)糊精水溶液0，2，4，6，8，10 mL于6個(gè)棕色玻璃瓶中，然后分別加入10，8，6，4，2，0 mL超純水，配成10 mL濃度分別為0×10-3，2×10-3，4×10-3，6×10-3，8×10-3，10×10-3mol/L的環(huán)糊精溶液[13]。均加入過(guò)量的山奈酚，超聲10 min，再置于搖床中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120 r/min，溫度分別為25，37，45 ℃，時(shí)間為72 h，振搖結(jié)束后靜置，待溶液達(dá)到平衡，用0.45 μm的濾膜過(guò)濾，取濾液1 mL于10 mL的棕色離心管中，超純水定容，在波長(zhǎng)367 nm測(cè)定不同濃度環(huán)糊精下山奈酚的吸光度[14,15]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)環(huán)糊精濃度下山奈酚的溶解度，以環(huán)糊精濃度為橫坐標(biāo)，山奈酚的溶解度為縱坐標(biāo)，繪制相溶解度曲線。判定線型關(guān)系，并計(jì)算包合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)。

1.2.3 環(huán)糊精/山奈酚包合過(guò)程的熱力學(xué)計(jì)算

山奈酚與不同環(huán)糊精在不同溫度(25，37，45 ℃)下的包合常數(shù)K，結(jié)合Van's Hoff方程可得：

△G=-RTlnK。

(1)

△G=△H-T△S。

(2)

可計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)△G。由方程(1)和(2)可得：

(3)

以lnK對(duì)1/T作線性回歸，根據(jù)直線的斜率和截距計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)△H和△S[16,17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 山奈酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of kaempferol

由圖1可知,回歸方程為y=0.1952x-0.0115，R2=0.9986，表明濃度在0～7.0×10-5mol/L范圍內(nèi)山奈酚的濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

716 Research progress of mesenchymal stem cell-derived exosomes in oxidative stress injury

2.2 山奈酚的相溶解度曲線

按1.2.2的方法計(jì)算不同溫度下不同濃度環(huán)糊精溶液中的山奈酚含量，通過(guò)山奈酚與環(huán)糊精濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，選擇合適的橫縱坐標(biāo)，繪制山奈酚在25，37，45 ℃條件下的相溶解度曲線，結(jié)果見圖2～圖4。

圖2 25 ℃時(shí)環(huán)糊精對(duì)山奈酚溶解度的影響Fig.2 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 25 ℃

圖3 37 ℃時(shí)環(huán)糊精對(duì)山奈酚溶解度的影響Fig.3 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 37 ℃

圖4 45 ℃時(shí)環(huán)糊精對(duì)山奈酚溶解度的影響Fig.4 Effect of cyclodextrin on the solubility of kaempferol at 45 ℃

由圖2～圖4可知，同一溫度下山奈酚的濃度隨著環(huán)糊精濃度的增加呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相溶解度曲線為AL型，說(shuō)明環(huán)糊精與山奈酚形成了1∶1的包合物。隨著環(huán)糊精濃度的依次增大，山奈酚的溶解度逐次遞增，在25，37，45 ℃下，SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD所在線段的斜率很高，說(shuō)明對(duì)山奈酚增溶效應(yīng)較為明顯，γ-CD、β-CD、Mal-β-CD、α-CD斜率則很小且相溶解度曲線很接近。增溶效果的順序?yàn)镾BE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD。

2.3 環(huán)糊精/山奈酚包合常數(shù)的計(jì)算

包合穩(wěn)定常數(shù)是衡量包合物穩(wěn)定性的重要參數(shù)，它反映了環(huán)糊精與藥物分子形成包合物時(shí)結(jié)合力的強(qiáng)弱，K值越大，包合效果越好，包合常數(shù)K值理論上只有AL型的溶解等溫線才可求出，而AN型計(jì)算較困難，一般將曲線開始的直線部分進(jìn)行線性回歸。

包合穩(wěn)定常數(shù)K=斜率/[ So×(1-斜率)]。

式中：斜率為相溶解度曲線的斜率；So為山奈酚在各溫度下水中的飽和溶解度[18,19]。

表1 環(huán)糊精對(duì)山奈酚的線性回歸方程 及包合常數(shù)KTable 1 Linear regression equation and inclusion constant K of cyclodextrin to kaempferol

由表1可知，在不同溫度下，8種環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶都呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，隨著溫度的升高，α-CD、β-CD、γ-CD、M-β-CD、SBE-β-CD、HE-β-CD、HP-β-CD對(duì)山奈酚的包合常數(shù)逐漸增大，說(shuō)明升高溫度有利于這7種環(huán)糊精與山奈酚包合平衡；而Mal-β-CD對(duì)山奈酚的包合常數(shù)隨著溫度的升高而減小，說(shuō)明升高溫度，不利于包合平衡。在同一溫度下，8種環(huán)糊精對(duì)山奈酚的包合常數(shù)的大小順序SBE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD，這可能與各種環(huán)糊精不同的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。SBE-β-CD對(duì)山奈酚的包合常數(shù)最大，在45 ℃時(shí)達(dá)到19082.1 mol/L，這是由于SBE-β-CD有帶負(fù)電荷的磺丁基，其基團(tuán)比-OH有更強(qiáng)的親水性，在水中的溶解度很好，能夠包合山奈酚并極大地提高其在水中的溶解度。

2.4 環(huán)糊精/山奈酚包合過(guò)程的熱力學(xué)計(jì)算

山奈酚與環(huán)糊精包合過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)見表2。

表2 山奈酚與環(huán)糊精包合過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermodynamic parameters of inclusion process of kaempferol and cyclodextrin

由表2可知，環(huán)糊精在不同溫度下與山奈酚包合的吉布斯自由能變化△G<0，表明環(huán)糊精與山奈酚的包合自發(fā)進(jìn)行，隨溫度升高，其負(fù)值逐漸增大，說(shuō)明高溫使包合的自發(fā)傾向增大；△H>0，表明環(huán)糊精與山奈酚的包合反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，升高溫度有利于包合反應(yīng)， Mal-β-CD與山奈酚包合的△H<0，說(shuō)明此包合反應(yīng)為放熱反應(yīng)，升高溫度不利于包合的進(jìn)行；△S>0，表明環(huán)糊精與山奈酚的包合反應(yīng)為熵增反應(yīng)，根據(jù)熱力學(xué)第二定律，疏水作用在包合過(guò)程中起主要作用。

2.5 不同環(huán)糊精對(duì)山奈酚增溶效應(yīng)分析

根據(jù)相溶解度的方法，測(cè)定不同溫度下山奈酚在8種環(huán)糊精的5個(gè)濃度中的溶解度和山奈酚在不同溫度下水中的飽和溶解度，分析環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶效應(yīng)(S/So)，其中S/So為增溶因子，表示各種環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶作用；S為山奈酚在各種環(huán)糊精中的濃度；So為山奈酚在水中的飽和溶解度[14]。山奈酚在25，37，45 ℃的水中的溶解度分別為7.0×10-5，8.0×10-5，9.0×10-5mol/L，不同濃度的環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶效果見表3。

表3 環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶效應(yīng)Table 3 Solubilization effect of cyclodextrin on kaempferol

由表3可知，環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶效果隨著環(huán)糊精濃度的增大而呈現(xiàn)遞增的趨勢(shì)。同一種環(huán)糊精，隨著溫度的增加，環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶效果增加。不同的環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶效果差異顯著，α-CD、β-CD、γ-CD對(duì)山奈酚的增溶作用很小，而SBE-β-CD對(duì)山奈酚的增溶作用極其顯著，SBE-β-CD的濃度在1×10-2mol/L、溫度為45 ℃時(shí)，其對(duì)山奈酚的增溶因子高達(dá)70.03，增溶效應(yīng)順序?yàn)镾BE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD。

3 結(jié)論

采用相溶解度法系統(tǒng)地研究了8種環(huán)糊精對(duì)山奈酚的增溶作用及包合過(guò)程中的熱力學(xué)參數(shù)，初步揭示了環(huán)糊精包合山奈酚的熱力學(xué)規(guī)律。研究表明山奈酚的溶解度隨著8種環(huán)糊精濃度的增加而呈線性遞增的趨勢(shì)，相溶解度曲線為AL型，環(huán)糊精與山奈酚形成的包合物類型為1∶1型，增溶效應(yīng)與環(huán)糊精濃度和溫度呈正相關(guān)，增溶效應(yīng)順序?yàn)镾BE-β-CD>HE-β-CD>M-β-CD>HP-β-CD>γ-CD>β-CD>Mal-β-CD>α-CD，α-CD的增溶效應(yīng)極小，而SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD的增溶效應(yīng)明顯。吉布斯自由能變化△G<0，包合過(guò)程為自發(fā)進(jìn)行；Mal-β-CD與山奈酚的焓變△H<0，此包合過(guò)程為放熱反應(yīng)，其他7種環(huán)糊精與山奈酚的△H>0，說(shuō)明此包合過(guò)程為吸熱反應(yīng)，升高溫度有利于包合的進(jìn)行；熵變△S>0，包合過(guò)程熵增。因此，可以根據(jù)山奈酚的應(yīng)用領(lǐng)域，選擇SBE-β-CD、HE-β-CD、M-β-CD、HP-β-CD包合山奈酚，提高山奈酚的溶解度，拓展山奈酚的應(yīng)用范圍。