姚東風(fēng)，許夢(mèng)榮，馬麗，鄧穎穎，張恩戶（陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室/陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西咸陽(yáng) 712046）

再生障礙性貧血（Aplastic anemia，AA）約占血液系統(tǒng)疾病的12.6%，是一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)疾病，該疾病因復(fù)雜、病程長(zhǎng)，治療較困難，其主要特征為骨髓造血功能障礙和外周血象[諸如紅細(xì)胞（RBC）、白細(xì)胞（WBC）、血小板（PLT）數(shù)目和血紅蛋白（HGB）含量] 減少以及貧血、感染和出血的發(fā)生[1-2]。骨髓抑制作為一種常見(jiàn)的骨髓造血功能異常的病癥，其主要特征為外周血中WBC、PLT數(shù)目急劇減少，進(jìn)而導(dǎo)致骨髓造血功能異常[3]。參芍益氣養(yǎng)血顆粒由陜西省血液病防治研究所附屬醫(yī)院研發(fā)制成，由紅參、白芍、黃芪、熟地黃、當(dāng)歸、淫羊藿、巴戟天、續(xù)斷、菟絲子、仙鶴草、白術(shù)（炒）、砂仁等十二味藥組成，具有益氣生津、養(yǎng)血斂陰、益精填髓等功效，用于治療AA及放、化療所致的外周血白細(xì)胞減少癥。針對(duì)此中成藥制劑，一直以來(lái)只有較少的療效觀察和臨床試驗(yàn)，尚未通過(guò)現(xiàn)代藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)AA及骨髓抑制的防治作用進(jìn)行驗(yàn)證。鑒于此，本課題組擬通過(guò)建立AA小鼠模型以及骨髓抑制小鼠模型，用以評(píng)估參芍益氣養(yǎng)血顆粒對(duì)AA的改善作用以及對(duì)骨髓抑制的防治作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BT224S電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；60Co放射源（空軍軍醫(yī)大學(xué)鈷源室）；BC-5300Vet全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；FT-200動(dòng)物跑步機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）；E100倒置光學(xué)顯微鏡[日本尼康映像儀器銷售（中國(guó)）有限公司] 。

1.2 藥品與試劑

參芍益氣養(yǎng)血顆粒（陜西省血液病防治研究所附屬醫(yī)院提供，由陜西郝其軍制藥股份有限公司委托生產(chǎn)，批號(hào)：20171001，規(guī)格：每g顆粒含生藥2.52 g）；益血生膠囊（吉林三九金復(fù)康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：170806，規(guī)格：0.25 g）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：17110425，規(guī)格：0.2 g）；注射用5-氟尿嘧啶（5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：FA170603，規(guī)格：10 mL∶0.25 g）；磷酸鹽緩沖液（PBS，西安赫特生物有限公司）；枸櫞酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；煌焦油藍(lán)染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

BALB/c小鼠72只，♂，SPF級(jí)，6周齡，體質(zhì)量25～30 g；KM小鼠90只，♂，SPF級(jí)，8周齡，體質(zhì)量18～22 g。以上小鼠均由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（軍）2012-0007。

2 方法

2.1 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對(duì)60Co-γ射線聯(lián)合CTX致AA模型小鼠的改善作用

2.1.1 造模、分組與給藥 取BALB/c小鼠72只，隨機(jī)取12只為空白組，剩余60只小鼠為造模組?？瞻捉M小鼠不作其他處理，給予常規(guī)飲食；造模組小鼠置于3.0 Gy60Co-γ射線下，以劑量率1.353 1 Gy/min、距離 70 cm照射4 min 51 s[4]，并于照射后第4、5、6天分別腹腔注射CTX 40 mg/kg，復(fù)制AA模型。注射完CTX后，隔天各取5只空白組和造模組小鼠眼球取血進(jìn)行RBC、WBC、HGB、PLT檢測(cè)，若造模組小鼠外周血象指標(biāo)較空白組顯著降低，則證實(shí)AA模型成立[5]。將60只造模成功的AA模型小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（益血生膠囊，以內(nèi)容物計(jì)為0.625 g/kg，為人臨床劑量的等效劑量）和參芍益氣養(yǎng)血顆粒低、中、高劑量組（以生藥量計(jì)分別為1.26、7.56、15.12 g/kg，分別相當(dāng)于人臨床劑量的1、6、12倍），每組12只。各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃7 d。

2.1.2 一般體征觀察 給藥期間每天觀察各組小鼠的精神活動(dòng)、毛發(fā)狀況、飲食、二便等一般體征。

2.1.3 力竭實(shí)驗(yàn)觀察 末次給藥前1天（即給藥第6天），將各組小鼠逐只置于動(dòng)物跑步機(jī)上，在轉(zhuǎn)速為35 r/min下跑步直至力竭，記錄小鼠力竭距離和力竭時(shí)間。

2.1.4 外周血象檢測(cè)及網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比（Ret）測(cè)定

末次給藥后1 h，眼球取血，采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)外周血象（RBC、WBC、PLT數(shù)目和HGB含量）；同時(shí)取血1滴置于1.5 mL離心管中，加入1滴煌焦油藍(lán)染色液，搖勻，靜置15 min后，吸取10 μL于載玻片上，推片，顯微鏡下進(jìn)行Ret計(jì)數(shù)。

2.1.5 骨髓有核細(xì)胞（BMNC）數(shù)目檢測(cè) 取血后處死小鼠，分離股骨，暴露兩端骨髓，用骨髓緩沖液（3.8%枸櫞酸鈉∶PBS＝1∶9）1 mL反復(fù)沖洗骨髓腔，得骨髓懸液。取骨髓懸液1小滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下直接讀取各視野內(nèi)的BMNC數(shù)目。

2.2 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對(duì)5-FU致小鼠骨髓抑制的防治作用

取90只KM小鼠按“2.1.1”項(xiàng)下方法分組、給藥，每組15只，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃12 d。給藥3 d后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射5-FU（125 mg/kg）1次；之后隔天腹腔注射5-FU（62.5 mg/kg）1次，共2次。腹腔注射3次5-FU后，取血檢測(cè)外周血象及BMNC數(shù)目，若變化與骨髓抑制模型相符，證實(shí)模型成立[6]。末次給藥12 h后，按“2.1.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行外周血象（RBC、WBC、PLT數(shù)目和HGB含量）檢測(cè)和Ret測(cè)定以及BMNC數(shù)目檢測(cè)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對(duì)60Co-γ射線聯(lián)合CTX致AA模型小鼠的改善作用

3.1.1 小鼠一般體征觀察結(jié)果 空白組小鼠活動(dòng)、飲食及二便均正常。與空白組比較，模型組小鼠活動(dòng)、飲食明顯減少，精神狀態(tài)不佳，大便稀薄，皮毛豎起，體型消瘦，體質(zhì)量減輕，耳、唇、甲部蒼白，呈貧血貌。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒中、高劑量組小鼠一般體征均有不同程度改善，小鼠活動(dòng)增強(qiáng)，飲食、二便恢復(fù)正常；而參芍益氣養(yǎng)血顆粒低劑量組小鼠一般體征與模型組無(wú)異。由于化療藥物CTX存在很嚴(yán)重的毒副作用，小鼠骨髓功能受到抑制時(shí)，其他功能也遭到損害，因此有部分小鼠死亡。其中，模型組有4只小鼠死亡，陽(yáng)性對(duì)照組有1只小鼠死亡，參芍益氣養(yǎng)血顆粒低、中、高劑量組分別有3、3、2只小鼠死亡。

3.1.2 力竭實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠力竭距離和力竭時(shí)間均顯著縮短（P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒中、高劑量組小鼠力竭距離和力竭時(shí)間均顯著延長(zhǎng)（P＜0.05或P＜0.01）。各組小鼠跑步力竭距離和力竭時(shí)間測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠跑步力竭距離和力竭時(shí)間測(cè)定結(jié)果（x±s）Tab 1 Determination results of exhaustion distance and exhaustion time of mice in each group（x±s）

3.1.3 小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目測(cè)定結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目和HGB含量）以及Ret、BMNC數(shù)目顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明模型組小鼠呈現(xiàn)出骨髓造血系統(tǒng)抑制現(xiàn)象；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒高劑量組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目和HGB含量）以及Ret、BMNC數(shù)目以及參芍益氣養(yǎng)血顆粒中劑量組小鼠Ret均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組AA模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組AA模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測(cè)定結(jié)果（x±s）Tab 2 Determination results of peripheral hemogram，Ret and BMNC number of AA model mice in each group（x±s）

3.2 參芍益氣養(yǎng)血顆粒對(duì)5-FU致骨髓抑制模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的影響

與空白組比較，模型組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目）、Ret和BMNC數(shù)目顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），但外周血象HGB含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），呈現(xiàn)出急性骨髓抑制的特征，與骨髓抑制的臨床特征一致；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和參芍益氣養(yǎng)血顆粒高劑量組小鼠外周血象（WBC、RBC、PLT數(shù)目）、Ret和BMNC數(shù)目以及參芍益氣養(yǎng)血顆粒中劑量組小鼠外周血RBC數(shù)目、Ret和BMNC數(shù)目均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各組骨髓抑制模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3（注：由于化療藥物5-FU對(duì)小鼠具有一定的肝腎損傷，部分小鼠死亡，導(dǎo)致除空白組外其余各組小鼠的只數(shù)均有減少）。

表3 各組骨髓抑制模型小鼠外周血象、Ret及BMNC數(shù)目的測(cè)定結(jié)果（x±s）Tab 3 Determination results of peripheral hemogram，Ret and BMNC number of myelosuppression model mice in each group（x±s）

4 討論

AA作為一種常見(jiàn)的血液系統(tǒng)疾病，其主要特征為以骨髓造血功能衰減，導(dǎo)致骨髓有核細(xì)胞增生低下、全血細(xì)胞減少，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染等病癥[7-9]。目前，對(duì)此常用骨髓移植的療法和免疫抑制治療，但骨髓移植費(fèi)用高，且骨髓難以匹配[10]；而免疫抑制治療死亡率高，易引發(fā)多種惡性疾病[11]。骨髓抑制作為腫瘤放、化療后最常見(jiàn)的一種毒性反應(yīng)[6]，其致病機(jī)制為化療藥物進(jìn)入體內(nèi)引起造血祖細(xì)胞（HPC）大量減少，而且會(huì)誘導(dǎo)干細(xì)胞的凋亡[12-14]，破壞骨髓基質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致骨髓造血功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致外周血象下降、Ret減少[4，15]。益血生膠囊作為一種已上市的中成藥制劑，主要用于治療脾腎兩虛、精血不足引起的AA及骨髓抑制等癥，對(duì)其具有良好的預(yù)防及治療作用[16]，因此在本研究中將其作為陽(yáng)性對(duì)照藥觀察對(duì)比參芍益氣養(yǎng)血顆粒的療效。

參芍益氣養(yǎng)血顆粒以益氣養(yǎng)血藥物為主，依據(jù)中醫(yī)經(jīng)典配方理論[17]，方中紅參、白芍為君藥，紅參可益氣、養(yǎng)陰、生津，白芍則可養(yǎng)血、斂陰，兩藥同用，有益氣生津之功；黃芪可益氣、養(yǎng)血，當(dāng)歸、熟地黃、仙鶴草可補(bǔ)血活血、止血，四藥共用可增強(qiáng)益氣養(yǎng)血之效，在方中共為臣藥；淫羊藿、巴戟天、菟絲子、續(xù)斷，四藥共用有健髓生血、壯陽(yáng)補(bǔ)腎之功，在方中亦為臣藥；炒白術(shù)可健脾益氣，砂仁可化濕行氣，二藥同用可補(bǔ)脾健胃，使脾胃運(yùn)化功能得以正常運(yùn)行，而脾胃為后天生化之源，因此二藥配伍應(yīng)用有利于氣血之恢復(fù)，在方中共為佐藥?？傊?，方中諸藥，配伍精當(dāng)，共奏益氣生津、健髓生血、壯陽(yáng)補(bǔ)腎、補(bǔ)脾健胃之功效，從而達(dá)到治療AA、骨髓增生異常綜合征、血小板減少癥及放化療致血細(xì)胞減少癥的目的[18] 。

目前AA模型的建立方法有多種，本課題組依據(jù)郭雨晨等[19]報(bào)道的AA模型建立方法，成功復(fù)制了AA模型。灌胃給藥后，發(fā)現(xiàn)小鼠在體征方面以及飲食、二便方面均恢復(fù)正常，并且可促進(jìn)AA模型小鼠外周血象WBC、RBC、PLT數(shù)目及HGB含量的恢復(fù)，以及Ret和BMNC數(shù)目的增加，表明骨髓造血功能得到了恢復(fù)，證實(shí)了參芍益氣養(yǎng)血顆粒有改善小鼠AA骨髓造血功能的作用。另外，本課題組參考了曹瑞等[20]的建模方法，成功復(fù)制了骨髓抑制小鼠模型。本課題組在建立骨髓抑制模型時(shí)采用造模與給藥同時(shí)進(jìn)行，主要為了避免單獨(dú)注射5-FU導(dǎo)致小鼠肝、腎毒性而大量死亡（課題組前期采用單獨(dú)注射5-FU，結(jié)果小鼠全部死亡）。本研究結(jié)果顯示，參芍益氣養(yǎng)血顆粒給藥后小鼠外周血象WBC、RBC、PLT數(shù)目增加，Ret增多，提示骨髓紅細(xì)胞的生成功能得到恢復(fù)[21]；BMNC數(shù)目顯著增加，提示骨髓造血功能恢復(fù)。以上結(jié)果提示，參芍益氣養(yǎng)血顆粒具有改善骨髓抑制模型小鼠骨髓造血功能的作用。

綜上所述，參芍益氣養(yǎng)血顆粒對(duì)小鼠AA和骨髓抑制具有一定的改善和防治作用，可使2種模型小鼠的骨髓造血功能逐漸恢復(fù)，其作用機(jī)制可能與改善造血微環(huán)境、恢復(fù)造血干細(xì)胞功能有關(guān)，然而對(duì)于藥物靶點(diǎn)作用機(jī)制和相關(guān)通路仍需進(jìn)一步探究。