池寧娟，劉明義，馮娟，石小鵬，楊志福，文愛東（空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安710032）

腦缺血再灌注（Cerebral ischemia/reperfusion，CI/R）后會引起一系列病理生理損傷，包括氧自由基損傷、鈣離子內(nèi)流、興奮性氨基酸大量釋放等[1-2]。目前，已認(rèn)識到神經(jīng)保護(hù)劑可作為治療CI/R損傷的方式，但大量神經(jīng)保護(hù)劑在臨床試驗(yàn)中的轉(zhuǎn)化失敗和不良反應(yīng)，使得抗CI/R損傷藥物的研究成為世界性難題[3-5]。中醫(yī)藥因其多靶點(diǎn)、多途徑等優(yōu)勢在治療CI/R損傷方面發(fā)揮著重要作用，成為近年來治療缺血性腦卒中的研究熱點(diǎn)[6-7]。

樂爾脈膠囊為我院研制的中藥復(fù)方制劑，由當(dāng)歸、黃芪、延胡索等五味藥組成，具有益氣、活血、化瘀等功效，臨床上用于治療缺血性腦血管疾病和腦中風(fēng)，能夠有效治療腦梗死兼瘀血癥、明顯改善患者的神經(jīng)功能。本課題組以往的研究表明，樂爾脈膠囊可作用于CI/R損傷后的炎性反應(yīng)和大腦皮層細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)[8-10]，從而發(fā)揮抗CI/R損傷的作用，但樂爾脈膠囊對CI/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激性腦損傷的作用還不清楚。核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是調(diào)控機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，氧化應(yīng)激條件下可激活抗氧化酶包括血紅素加氧酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶等[11]。故本研究擬采用大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）模型，觀察樂爾脈膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層組織中抗氧化應(yīng)激反應(yīng)因子HO-1、銅鋅超氧化物歧化酶（Copper-zinc superoxide dismutase，SOD1）、錳超氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase，SOD2）和Nrf2蛋白的影響，闡明其治療腦缺血的作用機(jī)制，為其臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BSA224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司] ；RM2235輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；680酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司）；SH01D臺式高速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；Aquaplore 3S超純水機(jī)（美國Aquapro公司）。

1.2 藥品與試劑

樂爾脈膠囊（由空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，批號：160402，規(guī)格：0.35 g）；腦心通膠囊（西安步長制藥有限公司，批號：160547，規(guī)格：0.4 g）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，上海埃彼化學(xué)試劑有限公司，批號：20160218）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：DH0006）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液（杭州弗德生物科技有限公司，批號：FD2001、FD008）；HO-1、SOD1、SOD2、Nrf2兔抗人多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：SC-164941、SC-160347、SC-160648、SC-160851）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（內(nèi)參）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BM0627、BA1054、AR1112）；其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

健康SD大鼠65只，♂，體質(zhì)量（270±10）g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（軍）2016-0007。所有大鼠均在環(huán)境溫度（25±1）℃、相對濕度45%～65%、光照時間12 h的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。本實(shí)驗(yàn)方案通過空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理審查。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

將65只大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組和樂爾脈膠囊高、低劑量組，每組13只。大鼠禁食過夜、自由飲水。次日，采用線栓法[12]復(fù)制MCAO/R大鼠模型。待大鼠清醒后回籠飼養(yǎng)，術(shù)后24 h開始灌胃給藥，其中假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃蒸餾水10 mL/kg，陽性對照組大鼠灌胃腦心通膠囊3.40 g/kg[13]，樂爾脈膠囊高、低劑量組大鼠分別灌胃樂爾脈膠囊0.37、0.18 g/kg（參考前期研究[8-9]及長期毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定給藥劑量，分別為人臨床用量的16.1、7.8倍），各組大鼠均每天灌胃1次，連續(xù)給藥7 d。

2.2 大鼠腦缺血面積測定

末次給藥2 h后，麻醉大鼠，每組取6只，斷頭取腦，置于預(yù)冷的生理鹽水中，冰浴10 min后，將其以冠狀面切成2.5 mm的切片，共取5～6片置于5 mL含有1.5%TTC的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，避光37℃孵育40 min，期間輕搖2次，待正常腦組織為玫瑰紅色、缺血區(qū)呈蒼白色時，棄去染液，將組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，然后用數(shù)碼相機(jī)拍照，用MiasPro圖像分析軟件測定缺血面積，并計(jì)算缺血面積比[缺血面積比（%）＝缺血面積/全腦面積×100%] 。

2.3 大鼠皮層組織病理學(xué)觀察

取“2.2”項(xiàng)下的大鼠大腦皮層組織，在4℃條件下置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋制成石蠟標(biāo)本，行4～6 μm切片，HE染色后，在顯微鏡下觀察其病理學(xué)變化。

2.4 大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達(dá)水平測定

每組取剩余7只大鼠，麻醉，斷頭取腦，取損傷側(cè)皮層組織，置于液氮中過夜，移至－80℃冰箱中凍存，備用。臨用時，取出凍存的大腦皮層組織，采用全蛋白提取液提取組織蛋白，以BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整上樣量為25 μg蛋白/泳道，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，濕法轉(zhuǎn)膜、封閉，分別與HO-1、SOD1、SOD2、Nrf2兔抗人多克隆抗體和β-actin抗體（稀釋比例均為1∶300）雜交，4℃孵育過夜，次日以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶5 000），37 ℃孵育50～70 min，然后以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光顯影，壓片，最后采用Gel-Pro Analyzer軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 樂爾脈膠囊對MCAO/R模型大鼠腦缺血面積的影響結(jié)果

TTC染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織無缺血情況；模型組大鼠腦組織損傷嚴(yán)重，腦缺血面積比為18.77%；與模型組比較，陽性對照組和樂爾脈膠囊高、低劑量組大鼠腦缺血面積比均顯著減小（P＜0.05），分別減小到12.19%、13.25%和11.35%。各組大鼠腦組織TTC染色圖見圖1，腦缺血面積比測定結(jié)果見圖2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色圖Fig 1 TTC staining of cerebral tissue in rats in each group

注：與假手術(shù)組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

3.2 大鼠皮層組織病理學(xué)觀察結(jié)果

假手術(shù)組大鼠大腦皮層組織結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞嗜色均勻，椎體細(xì)胞突起明顯，未見炎性細(xì)胞浸潤。模型組大鼠大腦皮層損傷側(cè)間質(zhì)重度水腫，細(xì)胞間隙明顯增大，炎性細(xì)胞浸潤明顯增加，小膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，神經(jīng)纖維斷裂，核深染，胞漿嗜酸性增多。與模型組比較，陽性對照組大鼠大腦皮層損傷側(cè)壞死區(qū)縮小，間質(zhì)水腫明顯降低，有少量炎性細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞增生；樂爾脈膠囊高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層損傷側(cè)范圍相對縮小，間質(zhì)水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，小膠質(zhì)細(xì)胞增生減弱；樂爾脈膠囊低劑量組大鼠大腦皮層損傷側(cè)組織損傷程度較模型組有明顯改善，損傷區(qū)中心炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，壞死空白區(qū)少見，形態(tài)完整，未見壞死區(qū)呈結(jié)節(jié)狀分布。各組大鼠大腦皮層組織病理學(xué)觀察顯微鏡圖見圖3。

圖3 各組大鼠大腦皮層組織病理學(xué)觀察顯微鏡圖（HE染色，×40）Fig 3 Histopathological micrograph of cerebral cortex in rats of each group（HE staining，×40）

3.3 樂爾脈膠囊對大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達(dá)水平的影響結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），SOD2、Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組大鼠大腦皮層組織中SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；而樂爾脈膠囊高、低劑量組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）。各組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2的蛋白電泳圖見圖4，測定結(jié)果見圖5。

4 討論

圖4 各組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2的蛋白電泳圖Fig 4 Electrophoretic diagrams for protein expression of HO-1，SOD1，SOD2 and Nrf2 in cerebral cortex of rats in each group

圖5 各組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果Fig 5 Protein expression of HO-1，SOD1，SOD2 and Nrf2 in cerebral cortex of rats in each group

在引起CI/R損傷的諸多因素中，備受關(guān)注的是氧化應(yīng)激損傷。氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化、DNA損傷等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和凋亡，因此抑制氧化應(yīng)激能夠有效減輕CI/R損傷[13]。生物在進(jìn)化過程中不斷完善自身復(fù)雜的防御功能，其中Nrf2、HO-1和SOD是體內(nèi)抗氧化應(yīng)激和維持氧化還原平衡的幾個重要因子[14-15]。Nrf2為調(diào)控機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子，參與激活多種與細(xì)胞保護(hù)和解毒相關(guān)基因的表達(dá)，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2被激活，使得Nrf2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，和下游基因HO-1抗氧化反應(yīng)片段結(jié)合，在氧化應(yīng)激細(xì)胞反應(yīng)中起重要作用[16-17]。SOD為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其按照結(jié)合金屬離子種類不同可分為SOD1、SOD2、鐵超氧化物歧化酶（Fe-superoxide dismutase）等，而SOD1和SOD2都能參與清除氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化性損傷[18]。

腦心通膠囊具有益氣活血、化瘀通絡(luò)的功效，臨床上用于氣虛血滯、脈絡(luò)瘀阻所致中風(fēng)的治療。有研究表明，腦心通膠囊能夠在一定程度上改善患者神經(jīng)功能缺損癥狀、提高腦梗死患者治療效果、降低腦梗死疾病復(fù)發(fā)率[19]，故本研究根據(jù)臨床療效和安全性，綜合考慮選則腦心通膠囊為本研究的陽性對照藥。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦缺血面積較假手術(shù)組顯著增加，大腦皮層損傷側(cè)間質(zhì)水腫明顯，炎性細(xì)胞浸潤增加；灌胃高、低劑量樂爾脈膠囊后可明顯減小模型大鼠腦缺血面積，縮小其大腦皮層損傷側(cè)范圍，減輕其間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤，明顯改善大腦皮質(zhì)組織形態(tài)，并且低劑量樂爾脈膠囊的效果優(yōu)于高劑量樂爾脈膠囊和陽性對照藥。筆者分析其可能原因，可能是由于樂爾脈膠囊為中藥復(fù)方制劑，其成分復(fù)雜，灌胃高劑量時對大鼠的副作用明顯增加，或有效成分入腦減少。Western blot檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠大腦皮層組織中HO-1和SOD1蛋白表達(dá)水平升高，SOD2、Nrf2蛋白表達(dá)水平降低；灌胃高、低劑量樂爾脈膠囊后大鼠大腦皮質(zhì)層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著升高。本研究結(jié)果顯示，MCAO/R后能引起抗氧化因子HO-1和SOD1蛋白表達(dá)增加，這是因?yàn)樾g(shù)后7 d隨著腦氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)，自由基生成增加，機(jī)體抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)也被動員，以對抗氧化應(yīng)激增強(qiáng)所致的組織損傷。有研究也證實(shí)，在CI/R損傷后，HO-1存在過表達(dá)，并可上調(diào)凋亡抑制基因的表達(dá)，而SOD1的過表達(dá)可減緩急性CI/R損傷[13，17]。

綜上所述，本研究在以往研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)了樂爾脈膠囊可通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮抗CI/R損傷的作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白的表達(dá)，但更多的機(jī)制有待進(jìn)一步考察。