寧國慶，吳潔，葛晨亮，周定榮，唐義信#（.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南衡陽400；.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中心實驗室，長沙 400）

急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）是 內(nèi)科常見的急癥，為冠心病中最兇險的一種[1]。心肌梗死早期及時恢復(fù)冠脈血流是挽救AMI患者的根本措施，但隨之誘發(fā)的心肌缺血再灌注（Ischemia reperfusion，IR）損傷，可能會進(jìn)一步擴(kuò)大心肌梗死面積。目前研究證實，心肌IR損傷機(jī)制主要表現(xiàn)為線粒體功能紊亂，從而引發(fā)心肌細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡和自噬[2-3]，因此，恢復(fù)線粒體的正常功能對于減輕心肌IR損傷具有重大臨床研究價值。目前，治療AMI的藥物很難滯留在缺血心肌部位，加之細(xì)胞膜屏障的阻礙，細(xì)胞攝取量少，到達(dá)線粒體效應(yīng)靶點的藥物量微乎其微，故需采用大劑量給藥，但大劑量藥物又可能誘發(fā)非靶向部位的藥物蓄積，導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。因此構(gòu)建一種新型載藥系統(tǒng)，增加藥物在心肌細(xì)胞內(nèi)的攝取量，盡量將藥物傳遞到線粒體，對于減少心肌細(xì)胞凋亡具有非常重要的科學(xué)研究價值。

黃芩苷（Baicalin，BAI）是從中藥黃芩（Scutellaria baicalensisGeorigi）的干燥根中提取的一種黃酮類成分，在心腦血管方面具有改善心肌IR損傷、改善腦組織損傷和抗心律失常等多種作用[4]。Wang XB等[5]研究發(fā)現(xiàn)，BAI預(yù)處理能夠抑制線粒體損傷介導(dǎo)的凋亡，減少心肌IR損傷。但BAI存在親水性和親油性均較差、體內(nèi)半衰期短等成藥性問題[6-7]。聚乙二醇衍生化磷脂酰乙醇胺（Polyethylene glycol-derivatized phosphatidylethanolamine，PEG-PE）是體內(nèi)可降解并經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)的可用于人體的藥物載體材料，常用于增加難溶性藥物的溶解度和提高藥物在體內(nèi)的靶向分布。有研究報道，PEG-PE納米膠束在缺血心肌部位具有很好的滲透與滯留（Enhanced permeability and retention time，EPR）效應(yīng)，能將藥物蓄積于缺血心肌部位，具有良好的心臟靶向性；PEG-PE納米膠束還可以促進(jìn)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運，有助于將藥物遞送到亞細(xì)胞器效應(yīng)部位[8-9]。因此，筆者以PEG-PE納米膠束為載體，制備了BAI@PEG-PE納米膠束，并對其進(jìn)行表征和細(xì)胞毒性研究，以期為AMI的治療提供新的選擇藥物。

1 材料

1.1 儀器

Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀（英國馬爾文公司）；Agilent 1200高效液相色譜（HPLC）儀（美國安捷倫公司）；Eyelan-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（亞宏科技有限公司）；VL2000DX-SVF17SP激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Lasertech公司）；BT25S電子分析天平（南京萊步科技實業(yè)有限公司）；TGL-16M臺式離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；JEM-2100透射電鏡（日本電子株式會社）。

1.2 藥品與試劑

BAI原料藥（成都銳可生物科技有限公司，批號：180522，純度：≥98%）；BAI對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110715-201117，供含量測定用，純度：≥98%）；PEG-PE（上海芃圣生物科技有限公司，批號：20190216）；香豆素6（C6，百靈威科技有限公司，批號：72609-201714，純度：≥98%）；氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，上海如吉生物科技有限公司）；線粒體紅色熒光探針（MitoTrackerTMRed）、細(xì)胞核染料Hoechst 33342均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcl-2）及其X蛋白（Bax）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）小鼠源單克隆抗體和二抗（艾美捷科有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（蘇州宇恒生物科技有限公司）；異丙腎上腺素（ISO，上海伊卡生物技術(shù)有限公司）；甲醇（美國Thermo Fisher試劑公司，色譜純）。

1.3 細(xì)胞

H9c2心肌細(xì)胞株購自南京科佰生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1BAI@PEG-PE納米膠束的制備

精密稱取BAI 10 mg、PEG-PE 40 mg置于旋蒸瓶中，加入甲醇約50 mL促使其完全溶解，通入氬氣進(jìn)行保護(hù)，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為50～120 r/min，由快至慢，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成一層均勻干燥薄膜，再將旋蒸瓶置于冰水浴中，抽真空干燥約10 h除去殘留有機(jī)溶劑，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）約5 mL，促使薄膜水合，再于40℃水浴下水化60 min，再超聲（頻率：40 Hz，功率：120 W）10 min，室溫下放置1 h，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾4～5次除去沉淀物，再真空冷凍干燥24 h，制得BAI@PEG-PE納米膠束凍干粉。

2.2BAI@PEG-PE納米膠束的外觀特征

稱取適量BAI@PEG-PE納米膠束凍干粉，加入蒸餾水，超聲（頻率：40 Hz，功率：120 W）5 min使粒子分散均勻，取少量滴加在200目銅網(wǎng)上，再用濾紙吸走多余的液體，室溫烘干，使用透射電鏡觀察BAI@PEG-PE納米膠束的外觀特征。BAI@PEG-PE納米膠束的透射電鏡圖見圖1。

圖1BAI@PEG-PE納米膠束的透射電鏡圖Fig 1 TEM of BAI@PEG-PE nanomicelles

由圖1顯示，BAI@PEG-PE納米膠束呈現(xiàn)大小比較均一的圓球形。

2.3BAI@PEG-PE納米膠束的表征

稱取適量BAI@PEG-PE納米膠束凍干粉，加入蒸餾水，超聲（頻率：40 Hz，功率：120 W）5 min使粒子分散均勻，使用Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀檢測膠束的粒徑分布、多分散系數(shù)（PDI）和Zeta電位。結(jié)果顯示，BAI@PEG-PE納米膠束的粒徑為（16.7±0.8）nm，PDI為 0.11±0.01，Zeta電位為（－18.4±0.6）mV（n＝3），粒徑分布圖見圖2，Zeta電位分布圖見圖3。

比較圖1和圖2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圖2中BAI@PEG-PE納米膠束的粒徑明顯大于圖1顯示的結(jié)果，這可能與Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀檢測的是水合粒徑有關(guān)。

2.4BAI@PEG-PE納米膠束的包封率與載藥量

圖2BAI@PEG-PE納米膠束的粒徑分布圖Fig 2 Distribution of particle size of BAI@PEG-PE nanomicelles

圖3 BAI@PEG-PE納米膠束的Zeta電位分布圖Fig 3 Distribution of Zeta-potential of BAI@PEG-PEnanomicelles

2.4.1 BAI的含量測定 參照2015年版《中國藥典》（一部）黃芩下BAI的含量測定方法[10]，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2，V/V/V）為流動相，檢測波長為280 nm，進(jìn)樣量為10 μL，理論板數(shù)按BAI峰計應(yīng)不低于2 500。方法驗證結(jié)果顯示，BAI檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為20～80 μg/mL（r＝0.999 9），精密度、穩(wěn)定性試驗中峰面積的RSD＜1%（n＝3），平均加樣回收率為99.8%（n＝3），該方法符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.2 包封率與載藥量 取BAI@PEG-PE納米膠束溶液500 μL，置于超濾離心管中，低溫下10 000 r/min離心5 min，取離心管內(nèi)的BAI@PEG-PE納米膠束溶液，冷凍干燥后稱質(zhì)量，記為m總，然后加入10倍體積量的甲醇破壞納米膠束結(jié)構(gòu)，檢測其中BAI質(zhì)量，記為m0；離心管外為游離BAI，測定游離BAI質(zhì)量，記為m1，計算BAI@PEG-PE納米膠束的包封率（EE，%）和載藥量（DL，%）。EE＝m0/（m1+m0）×100%，DL＝m0/m總×100%。結(jié)果顯示，BAI@PEG-PE納米膠束的包封率為（85.7±4.9）%、載藥量為（7.84±0.65）%（n＝3）。

2.5BAI@PEG-PE納米膠束的穩(wěn)定性

將BAI@PEG-PE納米膠束置于4℃的冰箱中放置2個月后檢測該膠束的粒徑、Zeta電位、載藥量和包封率。結(jié)果顯示，放置2個月后BAI@PEG-PE納米膠束的粒徑為（17.4±1.6）nm、Zeta電位為（－20.4±0.7）mV、載藥量為（8.06±0.37）%、包封率為（83.7±5.4）%，與放置前初始結(jié)果相差不大，故BAI@PEG-PE納米膠束在4℃下放置2個月的穩(wěn)定性良好。

2.6BAI@PEG-PE納米膠束的體外釋放

將BAI原料藥（100 μg）和BAI@PEG-PE納米膠束（含100 μg BAI）裝入透析袋（截留分子量為3 000）中，兩端采用夾子封閉，置于200 mL pH 7.4的PBS中，設(shè)定水溫為37 ℃。分別于1、3、6、9、12、16、20、24、36、48、60、72、84 h取樣，取樣體積為300 μL，取樣同時補(bǔ)充等溫等量的pH 7.4的PBS。參照2015年版《中國藥典》（一部）黃芩下BAI的含量測定方法[10]檢測各時間點取樣液中的BAI含量，計算BAI@PEG-PE納米膠束的累積釋放度（Q），繪制體外釋放曲線。BAI原料藥和BAI@PEG-PE納米膠束的體外釋放曲線見圖4。

圖4BAI原料藥和BAI@PEG-PE納米膠束的體外釋放曲線Fig 4 Release curve in vitro of BAI raw material and BAI@PEG-PE nanomicelles

由圖4可知，BAI在24 h內(nèi)已經(jīng)釋放達(dá)到92.1%，基本上釋放完全，而BAI@PEG-PE納米膠束有明顯的緩釋作用，84 h的累積釋放度僅為76.5%。

2.7 H9c2心肌細(xì)胞攝取

考慮到BAI自身無熒光，故采用帶綠色熒光的C6為熒光探針，按BAI@PEG-PE納米膠束的制備方法，采用薄膜水化法，將C6包埋于PEG-PE納米膠束親脂性內(nèi)核中，即可獲得帶綠色熒光的C6@PEG-PE納米膠束。將H9c2心肌細(xì)胞接種到12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1.0×105個/孔，培養(yǎng)24 h。然后將C6@PEG-PE納米膠束或者C6分別與H9c2心肌細(xì)胞共同孵育，C6的質(zhì)量濃度為100 ng/mL，孵育4 h后，采用線粒體紅色熒光探針染色，最后采用少量pH 7.4的PBS洗滌細(xì)胞數(shù)次，盡量清除細(xì)胞外殘留的熒光物質(zhì)，最后采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。激光掃描共聚焦圖見圖5。

由圖5顯示，C6有少量進(jìn)入H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)，并與線粒體重合，顯示黃色，與文獻(xiàn)[11-12] 報道一致，其可能的原因是親脂性C6在親水性細(xì)胞液中跨膜轉(zhuǎn)運相對困難，因此攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的量相對較少。與C6比較，C6@PEG-PE納米膠束進(jìn)入H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)的量明顯較多，且大量與紅色的線粒體部位重合。由此可見，PEG-PE納米膠束不僅能顯著增強(qiáng)C6的水溶性，還可能誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞形成臨時性的孔道，便于C6跨膜轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞。提示PEG-PE納米膠束能顯著增加藥物的H9c2心肌細(xì)胞攝取量，并使藥物聚集在線粒體部位。

2.8 體外細(xì)胞凋亡試驗

圖5 激光掃描共聚焦圖（×500）Fig 5Laser scanning confocal map（×500）

2.8.1 細(xì)胞處理與分組 將H9c2心肌細(xì)胞接種到12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度為1.0×105個/孔，培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分為模型組、BAI原料藥組和BAI@PEG-PE納米膠束組。模型組參照文獻(xiàn)報道方法[13-14]，以無血清DMEM培養(yǎng)液加入ISO 10 μmol/L與H9c2心肌細(xì)胞共同孵育24 h復(fù)制心肌細(xì)胞凋亡模型；BAI原料藥組細(xì)胞先在培養(yǎng)基中加入30 μmol/L BAI原料藥預(yù)處理0.5 h，再加入ISO 10 μmol/L共同孵育24 h；BAI@PEG-PE納米膠束組細(xì)胞先在培養(yǎng)基中加入30 μmol/L BAI@PEG-PE納米膠束預(yù)處理0.5 h，再加入ISO 10 μmol/L作用24 h。

2.8.2 Hoechst染色觀察凋亡細(xì)胞數(shù)量 取H9c2心肌細(xì)胞，按“2.7.1”項下方法分組培養(yǎng)后，用4%甲醛溶液固定，再以PBS洗滌數(shù)次，用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色，再采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，統(tǒng)計凋亡率。各組細(xì)胞Hoechst染色圖見圖6（圖中 所指為藍(lán)色光斑），細(xì)胞凋亡率的測定結(jié)果見圖7。

由圖6和圖7顯示，模型組細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的暗淡、皺縮，碎裂的且呈明亮藍(lán)色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。BAI原料藥組和BAI@PEG-PE納米膠束組的凋亡細(xì)胞顯著少于模型組（P＜0.01），其中BAI@PEG-PE納米膠束組的凋亡細(xì)胞最少（P＜0.01）。表明BAI@PEG-PE納米膠束的抗心肌細(xì)胞凋亡效果作用優(yōu)于BAI原料藥。

圖6 各組細(xì)胞Hoechst染色圖（×300）Fig 6Hoechst staining of cell in each group（×300）

圖7 各組細(xì)胞凋亡率的測定結(jié)果Fig 7 Apoptosis rate of cell in each group

2.8.3 Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 采用Western blot法檢測細(xì)胞中凋亡相關(guān)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。取H9c2心肌細(xì)胞，按“2.7.1”項下方法分組培養(yǎng)后，提取總蛋白，定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜中，封閉，加入兔抗鼠Bcl-2（稀釋比例：1∶1 000）、Bax（稀釋比例：1∶1 000）單克隆抗體孵育后，用TBST緩沖液清洗，再加入二抗進(jìn)行孵育，次日TBST緩沖液洗膜，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測液顯影定影后，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH的比值進(jìn)行評價，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。各組細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的電泳圖見圖8，蛋白表達(dá)測定結(jié)果見圖9。

由圖8和圖9顯示，與模型組比較，BAI原料藥組和BAI@PEG-PE納米膠束組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中BAI@PEG-PE納米膠束組的上述效果強(qiáng)于BAI原料藥組（P＜0.05）。

3 討論

圖8 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的電泳圖Fig 8 Electrophoretogram of protein expression of Bcl-2 and Bax of cell in each group

圖9 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的測定結(jié)果Fig 9 Protein expression of Bcl-2 and Bax of cell in each group

PEG-PE的外殼PEG具有良好的水溶性、生物相容性和無免疫原性，可以減弱體內(nèi)免疫系統(tǒng)如肝脾網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的特異性識別功能，加之其大分子尺寸結(jié)構(gòu)，不易被腎小球濾過，故在體內(nèi)可以長循環(huán)，從而延長藥物的體內(nèi)作用時間[15]。內(nèi)核PE具有良好的親脂性，BAI屬于難溶于水的黃酮類成分，具有一定的疏水性，恰好可以融合在疏水性內(nèi)核PE中。本研究以PEG-PE納米膠束為載體材料，將難溶性BAI包埋在膠束內(nèi)核中，表征結(jié)果顯示BAI@PEG-PE納米膠束具有粒徑小、包封率及載藥量高等優(yōu)良特點。體外釋放結(jié)果表明，BAI@PEGPE納米膠束在初期24 h釋放較快，突釋主要是由于膠束表面吸附或不完全包埋藥物迅速釋放的結(jié)果，24 h后釋藥比較相對緩慢，緩釋是由于藥物被PEG-PE納米膠束包埋于內(nèi)核中，與親脂性內(nèi)核PE完全融合在一起，較難解離釋放，這樣一來可以減少藥物在體內(nèi)循環(huán)過程中的損失，從而將更多的藥物輸送到有效部位。

本試驗以具有綠色熒光的C6為探針，制備成C6@PEG-PE納米膠束，與C6相比，結(jié)果顯示H9c2心肌細(xì)胞攝取C6@PEG-PE納米膠束的量顯著增加，且進(jìn)入細(xì)胞后還能富集在心肌細(xì)胞線粒體周圍，這樣有助于藥物在該細(xì)胞器部位發(fā)揮療效。心肌細(xì)胞凋亡試驗結(jié)果顯示，BAI@PEG-PE納米膠束可以明顯降低細(xì)胞凋亡率，還能顯著抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，提高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，進(jìn)一步可以推測PEG-PE納米膠束可以增加BAI在細(xì)胞內(nèi)的攝取量，還能有助于遞送BAI至線粒體部位，故抗心肌細(xì)胞凋亡作用顯著強(qiáng)于BAI原料藥。

綜上所述，BAI@PEG-PE納米膠束具有粒徑小、高包封率、緩慢釋藥等優(yōu)勢，還能促進(jìn)BAI的心肌細(xì)胞攝取，并聚集在線粒體部位，顯著提高藥物的抗心肌細(xì)胞凋亡作用。