王 崢， 胡 芳， 孫 瑩， 陳楊麗

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科， 廣東 珠海 519000)

大血管病變是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，也是引起患者死亡和致殘的主要因素之一[1]。糖尿病引起的大血管病變是一個(gè)復(fù)雜的病理生理學(xué)過程，其中各種損傷因素造成的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)過度增殖是血管粥樣硬化形成、血管壁增厚、 管腔狹窄、 血管順應(yīng)性降低及血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)[2]。雖然已經(jīng)明確高血糖是引起VSMC過度增殖的因素之一，但其具體的分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。近期研究顯示，長鏈非編碼RNA心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(long non-coding RNA myocardial infarction associated transcript，lncRNA-MIAT)在糖尿病引起的血管病變中扮演重要角色，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[3]。但lncRNA-MIAT是否在高糖引起的VSMC細(xì)胞活力異常中發(fā)揮調(diào)控作用還未見報(bào)道。另一方面，本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)微小RNA-145(microRNA-145, miR-145)可能受lncRNA-MIAT的調(diào)控，而microRNA-145被證明是調(diào)控VSMC活力及增殖的重要分子[4]。因此本研究假設(shè)lncRNA-MIAT可以通過調(diào)控microRNA-145參與高糖引起的VSMC活力異常，并設(shè)計(jì)體外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)道如下。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

清潔級(jí)SD大鼠(雌雄不限，體質(zhì)量200 g左右)，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(粵)2016-0029。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 2000試劑盒、Lipofectamine RNAiMAX、TRIzol試劑和TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SYBR? Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；pcDNA3.1-MIAT真核表達(dá)質(zhì)粒、microRNA-145模擬序列(miR-145 mimic)、microRNA-145抑制序列(miR-145 inhibitor)及無關(guān)序列均購自廣州銳博生物；CellTiter-Blue試劑盒和雙螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；microRNA-145和U6的引物購自QIAGEN。

2 方法

2.1 大鼠主動(dòng)脈VSMC的分離及培養(yǎng) 大鼠經(jīng)腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，無菌條件下剪開腹腔和胸腔，取出主動(dòng)脈，體視顯微鏡下分離取出血管中膜組織，充分剪碎獲取的中膜組織。將剪碎的組織置入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中豎直放置5 h，待組織黏附后，平放細(xì)胞培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液1次，當(dāng)組織塊周圍細(xì)胞融合達(dá)到80%左右時(shí)常規(guī)傳代，取2代后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，確認(rèn)為血管平滑肌細(xì)胞后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。非高糖處理的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)(培養(yǎng)基葡萄糖濃度為5 mmol/L)，需進(jìn)行高糖處理的細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為25 mmol/L的培養(yǎng)基中。

2.2 細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染 通過向VSMC轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT真核表達(dá)質(zhì)粒和MIAT小干擾RNA(MIAT small interfering RNA,MIAT-siRNA)分別實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)lncRNA-MIAT的過表達(dá)和沉默。通過向VSMC轉(zhuǎn)染miR-145 mimic和miR-145 inhibitor分別實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)microRNA-145的過表達(dá)和沉默。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine?2000試劑進(jìn)行，同時(shí)使用pcDNA3.1空質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染對(duì)照。MIAT-siRNA、microRNA模擬序列及抑制序列的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine?RNAiMAX試劑。使用轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的細(xì)胞作為轉(zhuǎn)染對(duì)照。

2.3 細(xì)胞分組 根據(jù)是否進(jìn)行高糖刺激及轉(zhuǎn)染處理的不同，將細(xì)胞分為非高糖培養(yǎng)(non-high glucose)組和高糖培養(yǎng)(high glucose)組; 非高糖培養(yǎng)組再分為3個(gè)亞組，包括陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照(negative transfection control)亞組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組及pcDNA3.1-MIAT+miR-145 mimic共轉(zhuǎn)染亞組；高糖培養(yǎng)組也分為3個(gè)亞組，包括陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照亞組、轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組及MIAT-siRNA+ miR-145 inhibitor共轉(zhuǎn)染亞組。

2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 使用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞樣本中的總RNA。mRNA的反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT 試劑盒。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，對(duì)cDNA的進(jìn)行定量擴(kuò)增，試劑盒選用SYBR? Premix Ex TaqTM，標(biāo)準(zhǔn)化采用GAPDH。MicroRNA的反轉(zhuǎn)錄采用TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成試劑盒，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后使用miScript SYBR Green PCR 試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)化采用U6。獲取循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)之后采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算目的基因的相對(duì)水平。lncRNA-MIAT的上游引物序列為5’-ATCCTCGAGACAAAGAGCCCTCTGCACTAG-3’，下游引物序列為5’-ATCGGATCCGAGCAAATGGAGACAAAGGAC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CATGTTCGTCATGGGGTGAACCA-3’，下游引物序列為5’-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’。 MicroRNA-145及U6均采用商品化的miScript引物。

2.5 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 將各組細(xì)胞以每孔5 000個(gè)的密度種植于96孔板，于種植后24 h及72 h分別使用CellTiter-Blue試劑盒測定各組細(xì)胞573 nm波長處的吸光度(A)值，并根據(jù)公式計(jì)算72 h時(shí)點(diǎn)相對(duì)于24 h時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞活力相對(duì)變化。細(xì)胞相對(duì)活力(%)=72 hA值/24 hA值×100%。

2.6 生物信息學(xué)分析及雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 使用miRcode lncRNA-microRNA互作預(yù)測系統(tǒng)預(yù)測lncRNA-MIAT與microRNA-145的結(jié)合能力，尋找兩者可能互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。為驗(yàn)證生物信息學(xué)分析的結(jié)果，采用雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確認(rèn)lncRNA-MIAT與microRNA-145的結(jié)合能力：首先構(gòu)建不含任何突變的野生型lncRNA-MIAT螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，命名為pmirGro-MIAT-WT；同時(shí)對(duì)lncRNA-MIAT中上述生物信息學(xué)預(yù)測到的結(jié)合區(qū)域進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型lncRNA-MIAT螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，命名為pmirGro-MIAT-MUT，使用microRNA-145 mimic(同時(shí)使用無關(guān)序列作為陰性對(duì)照)與上述2種螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染VSMC，隨后采用雙螢光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的相對(duì)螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R語言，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)的形式表示。兩組間的均數(shù)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析，隨后采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高糖刺激引起大鼠VSMC中l(wèi)ncRNA-MIAT的增高及microRNA-145水平的降低

非高糖培養(yǎng)組細(xì)胞lncRNA-MIAT的相對(duì)水平為1.00±0.02，高糖培養(yǎng)組的lncRNA-MIAT相對(duì)水平為2.26±0.15，較非高糖培養(yǎng)組顯著升高(P<0.01)。非高糖培養(yǎng)組細(xì)胞microRNA-145的相對(duì)水平為1.00±0.05，高糖培養(yǎng)組的microRNA-145相對(duì)水平為0.61±0.09，較非高糖培養(yǎng)組顯著降低(P<0.01)，見圖1。該結(jié)果提示高糖刺激可以引起lncRNA-MIAT水平的升高，但是會(huì)抑制microRNA-145的表達(dá)。

Figure 1. The changes of lncRNA-MIAT and microRNA-145 le-vels in the VSMC cultured in non-high glucose and high glucose media. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsnon-high glucose group.

圖1 非高糖培養(yǎng)及高糖培養(yǎng)后的血管平滑肌細(xì)胞lncRNA-MIAT和microRNA-145水平的變化

2 lncRNA-MIAT通過調(diào)控microRNA-145促進(jìn)大鼠VSMC活力

對(duì)于非高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照亞組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組72 h的細(xì)胞相對(duì)活力顯著升高(P<0.01)。對(duì)于高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照亞組相比，轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組72 h的細(xì)胞相對(duì)活力顯著降低(P<0.01)。高糖培養(yǎng)組的陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照亞組的細(xì)胞相對(duì)活力顯著高于非高糖培養(yǎng)組的陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照亞組(P<0.01)。更為重要的是，在非高糖培養(yǎng)組中，pcDNA3.1-MIAT+miR-145 mimic共轉(zhuǎn)染亞組的細(xì)胞相對(duì)活力顯著低于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組(P<0.01);在高糖培養(yǎng)組，MIAT-siRNA+ miR-145 inhibitor共轉(zhuǎn)染亞組的細(xì)胞相對(duì)活力顯著高于轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組(P<0.01),見圖2、3。上述結(jié)果提示高糖處理可誘導(dǎo)VSMC活力，lncRNA-MIAT具有促進(jìn)VSMC活力的作用，而microRNA-145具有抑制VSMC活力的作用，lncRNA-MIAT對(duì)VSMC活力的調(diào)控依賴于micro-RNA-145的水平。

Figure 2. The viability changes of VSMC cultured in non-high glucose medium after transfection. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsnegative transfection control group;##P<0.01vspcDNA3.1-MIAT group.

圖2 非高糖處理培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞活力變化

Figure 3. The viability changes of VSMC cultured in high glucose medium after transfection. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsnegative transfection control group;##P<0.01vsMIAT-siRNA group.

圖3 高糖培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞活力變化

3 lncRNA-MIAT負(fù)向調(diào)控microRNA-145

RT-qPCR結(jié)果顯示， 對(duì)于非高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照亞組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組的microRNA-145相對(duì)水平顯著降低(P<0.05)。對(duì)于高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對(duì)照亞組相比，轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組的microRNA-145相對(duì)水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、5。該結(jié)果提示lncRNA-MIAT可以抑制microRNA-145的表達(dá)。miRcode lncRNA-microRNA互作預(yù)測系統(tǒng)的結(jié)果提示, lncRNA-MIAT與microRNA-145存在互補(bǔ)結(jié)合的區(qū)域。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)的結(jié)果顯示，相對(duì)于共轉(zhuǎn)染microRNA-145 mimic與pmirGLO-MIAT-MUT質(zhì)粒的細(xì)胞,共轉(zhuǎn)染microRNA-145 mimic與pmirGLO-MIAT-WT質(zhì)粒的細(xì)胞相對(duì)螢光素酶活性顯著降低(P<0.01)，見圖6。該結(jié)果提示lncRNA-MIAT確實(shí)可以與microRNA-145直接靶向結(jié)合，可能以“核酸海綿”的形式抑制microRNA-145的表達(dá)。

Figure 4. MicroNRA-145 level in VSMC cultured in non-high glucose medium after lncRNA-MIAT over-expression. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsnegative transfection control group.

圖4 非高糖培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA-MIAT后的microRNA-145水平

討 論

糖尿病患者的大血管病變主要以動(dòng)脈粥樣硬化為主，超過80%左右的糖尿病患者的死亡原因與動(dòng)脈粥樣硬化引起的心腦血管事件相關(guān)[5-6]。糖尿病患者罹患動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)顯著提高且病變較非糖尿病患者來說更加彌漫復(fù)雜，預(yù)后更差[7]。糖尿病患者高血糖、高胰島素血癥及血脂蛋白代謝紊亂等損傷因素造成的VSMC增殖過度是血管內(nèi)膜增厚、新生內(nèi)膜形成、纖維帽子形成及管腔狹窄的主要原因，被認(rèn)為是糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要病理生理學(xué)環(huán)節(jié)[8-9]。因此采用干預(yù)手段防止VSMC的增殖過度可能對(duì)糖尿病大血管病變的防治具有重要意義。高血糖是糖尿病患者的共同標(biāo)志性的特征，且被證實(shí)是糖尿病患者發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素[10-11]，因此探討高糖引起VSMC過度增殖的機(jī)制并設(shè)計(jì)干預(yù)措施的臨床意義更為重大。

Figure 5. MicroNRA-145 level in VSMC cultured in high glucose medium after lncRNA-MIAT silencing. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsnegative transfection control group.

圖5 高糖培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中沉默lncRNA-MIAT后的microRNA-145水平

Figure 6. Relative luciferase activity changes of the VSMC detected by dual-luciferase reporter assay. Mean±SD.n=5.**P<0.01vspmirGro-MIAT-MUT.

圖6 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中細(xì)胞的相對(duì)螢光素酶活性變化

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本超過200個(gè)核苷酸單位的非編碼RNA，雖不編碼蛋白質(zhì)，但在染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及蛋白質(zhì)代謝等方面均發(fā)揮重要的作用，因此參與各種疾病的調(diào)控[12-13]。本研究主要關(guān)注lncRNA-MIAT在高血糖引起的VSMC過度增殖中扮演的角色。lncRNA-MIAT已經(jīng)被證實(shí)參與糖尿病并發(fā)的血管病變。如Yan等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜微血管組織中存在lncRNA-MIAT的高表達(dá)，在高糖環(huán)節(jié)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中也存在lncRNA-MIAT高表達(dá)且可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂。但是還沒有研究證實(shí)lncRNA-MIAT在是否參與糖尿病患者大血管的病變，且沒有研究表明其是否與高糖下VSMC的增殖過度有關(guān)。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖刺激后的大鼠VSMC出現(xiàn)了lncRNA-MIAT的高表達(dá)，而敲減細(xì)胞內(nèi)lncRNA-MIAT的表達(dá)后，高糖刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞活力增高作用被減弱。上調(diào)非高糖培養(yǎng)環(huán)境下VSMC的lncRNA-MIAT后，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的活力增加。因此本研究認(rèn)為lncRNA-MIAT具有促進(jìn)VSMC活力的作用，可參與高糖引起的VSMC活力異常。

lncRNA發(fā)揮調(diào)控作用的機(jī)制比較復(fù)雜，其中一個(gè)較為重要的機(jī)制是競爭性內(nèi)源RNA學(xué)說，即lncRNA可以作為“核酸海綿”，吸附相應(yīng)的可與之互補(bǔ)的microRNA，導(dǎo)致該microRNA的游離分子減少，間接導(dǎo)致該microRNA的靶基因水平發(fā)生改變[14]?；谶@個(gè)學(xué)說，本研究認(rèn)為lncRNA-MIAT可能通過某個(gè)microRNA分子發(fā)揮作用。通過生物信息學(xué)分析我們發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MIAT可以和若干microRNA分子互補(bǔ)，這些microRNA中包括microRNA-145。之所以進(jìn)一步關(guān)注microRNA-145，是因?yàn)橐呀?jīng)有研究證實(shí)microRNA-145是VSMC中含量最豐富的micro-RNA，不但可以調(diào)控VSMC的表型也可以調(diào)控其增殖和遷移。有研究指出，高血糖可以抑制VSMC的microRNA-145表達(dá)，而microRNA-145本身具有抑制VSMC增殖的作用,因此microRNA-145很可能參與糖尿病引起的血管病變，特別是參與該過程中VSMC的損傷[15]。在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，本研究通過轉(zhuǎn)染改變了VSMC的lncRNA-MIAT水平，同時(shí)檢測了microRNA-145的表達(dá)變化，結(jié)果提示lncRNA-MIAT能夠抑制microRNA-145的水平。進(jìn)一步的雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明lncRNA-MIAT確實(shí)可以和microRNA-145互補(bǔ)結(jié)合。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)microRNA-145在高糖刺激的VSMC中低表達(dá)，且確實(shí)發(fā)揮抑制VMSC活力的作用，與既往研究一致。綜合這些結(jié)果，我們認(rèn)為lncRNA-MIAT可以通過調(diào)控microRNA-145來實(shí)現(xiàn)對(duì)高糖刺激下VMSC活力的影響。當(dāng)然，根據(jù)競爭性內(nèi)源RNA學(xué)說，lncRNA-MIAT如能對(duì)microRNA-145實(shí)現(xiàn)調(diào)控，則同時(shí)能改變microRNA-145靶基因的水平，但本研究沒對(duì)這些microRNA-145的靶基因進(jìn)行探討，這是本研究的缺陷。一些報(bào)道證實(shí)，microRNA-145參與調(diào)控VSMC功能的靶基因主要有MMP-9、KLF4、KLF5、ELK1、肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等。未來研究可以著眼于探討lncRNA-MIAT對(duì)上述基因的調(diào)控。

總之，本研究的結(jié)果提示lncRNA-MIAT可能通過抑制microRNA-145促進(jìn)VSMC的活力，這可能是高血糖導(dǎo)致VSMC活力增加的一個(gè)機(jī)制。靶向抑制lncRNA-MIAT可能有利于糖尿病大血管病變的防治。