韓敬麗， 鄒麗輝， 金軍華， 李文卿， 李 英， 肖 飛△

(1 北京大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院， 2北京醫(yī)院衛(wèi)生部北京老年醫(yī)學(xué)中心老年醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100730)

纖溶酶原激活物抑制劑2(plasminogen activator inhibitor 2, PAI-2)又稱為SERPINB-2，是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，在細(xì)胞外發(fā)揮作用以限制尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，uPA)的活性[1]，因此，它可以參與調(diào)節(jié)纖維蛋白溶解和直接參與降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而在炎癥反應(yīng)、組織重塑、傷口愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮功能[2]。PAI-2基因位于18q21.3，由8個(gè)外顯子構(gòu)成，長(zhǎng)約16.5 kb。該基因表達(dá)可受多種因子調(diào)控，其啟動(dòng)子區(qū)域有2個(gè)AP1結(jié)合位點(diǎn)，還含有cAMP 反應(yīng)元件，并受生長(zhǎng)因子[如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(trans-forming growth factor-β,TGF-β)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)]、激素(如視黃酸和維生素D3)、細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1和IL-2)及腫瘤啟動(dòng)子(如佛波酯)等調(diào)控[3]。

我們前期的差異基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，一氧化氮-可溶性鳥苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸鳥苷(nitric oxide- soluble guanylyl cyclase-cyclic guanosine monophosphate，NO-sGC-cGMP)信號(hào)通路可調(diào)控PAI-2基因表達(dá)[4]。此外，我們?cè)谌朔蝿?dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human pulmonary arterial smooth muscle cells,HPASMCs)中發(fā)現(xiàn)PAI-2具有抗增殖、抗遷移和促凋亡的作用[5]。但NO-sGC-cGMP信號(hào)通路調(diào)控PAI-2基因表達(dá)的具體分子機(jī)制尚不清楚。在生物體內(nèi)，cGMP的作用方式主要為2種，一種是由cGMP及其同系物作為離子通道的配體直接參與細(xì)胞功能的調(diào)控，另一種是間接作用，也是cGMP作用的主要方式，通過激活cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinase，cGK)發(fā)揮作用。cGK是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在HPASMCs中也是cGMP的主要效應(yīng)蛋白[6]。

為了進(jìn)一步闡明在HPASMCs中NO-sGC-cGMP信號(hào)通路是否也是通過cGK調(diào)控PAI-2基因表達(dá)，本研究通過構(gòu)建cGK的真核過表達(dá)載體及其小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)敲減體系，分析PAI-2基因不同啟動(dòng)子區(qū)域的活性，從而揭示PAI-2基因表達(dá)的具體分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

HPASMCs和平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基SMCM均購(gòu)自ScienCell；真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)為本實(shí)驗(yàn)室保存；DNA聚合酶和DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa；限制性DNA 內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs；DNA凝膠純化回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司；雙螢光素酶報(bào)告試劑盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購(gòu)于Promega；TRIzol試劑、細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine 3000 Transfection Reagent)和莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自Invitrogen；BAY 41-2272購(gòu)自MCE；PRKG1抗體購(gòu)自Proteintech；山羊抗兔IgG (H+L)抗體購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；小鼠抗β-actin單抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)； Protease Inhibitor Cocktail購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；Immobilon Western HRP底物購(gòu)自Merch Millipore。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞置于含2%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素及生長(zhǎng)因子的SMCM，于37 ℃、5% CO2環(huán)境培養(yǎng)。細(xì)胞隔天更換培養(yǎng)基，傳代比例1 3。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和細(xì)胞處理 按照Lipofectamine 3000 Transfection Reagent標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案將攜帶目的基因的真核表達(dá)載體或siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HPASMCs。細(xì)胞轉(zhuǎn)染6 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基，BAY 41-2272以100 μmol/L工作濃度處理24 h，對(duì)照組加入等量DMSO平行培養(yǎng)。

2.3PAI-2啟動(dòng)子的克隆 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成：利用Primer軟件包在PAI-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2.1 kb處依次設(shè)計(jì)啟動(dòng)子缺失突變體上、下游引物，在引物序列5’端加上SpeI酶切位點(diǎn)，3’端加上NheI酶切位點(diǎn)，野生型和各啟動(dòng)子缺失突變體共用一條下游引物，擴(kuò)增片段插入螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，同時(shí)設(shè)計(jì)內(nèi)參照β-actin上、下游引物序列，引物序列由上海生工生物工程公司合成。同樣設(shè)計(jì)cGK和PAI-2的real-time PCR引物。引物名稱及其核苷酸序列見表1。 真核表達(dá)載體的構(gòu)建：以HPASMCs基因組DNA為模板，采用PCR方法獲得啟動(dòng)子目的片段及其亞克隆片段，回收后分別與經(jīng)過相同酶切處理的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)大片段連接。連接產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定，獲得正確表達(dá)質(zhì)粒。

表1 用于構(gòu)建PAI-2基因啟動(dòng)子缺失體和cGK過表達(dá)質(zhì)粒的引物核苷酸序列

2.4 細(xì)胞總RNA提取和RT-PCR 收集細(xì)胞后按照常規(guī)TRIzol抽提法提取細(xì)胞總RNA，將提取的RNA溶于DEPC處理的去離子水中，通過NanoDrop 2000C定量。用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。用β-actin作為內(nèi)參照，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增PAI-2，反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L)1 μL，基因引物0.l μmol/L，Taq酶1.5 U，加入去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為：98 ℃變性5 min;98 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸10 min。將反應(yīng)產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳分析。

2.5 Real-time PCR Real-timePCR反應(yīng)根據(jù)SYBR Green方法進(jìn)行半定量，iQ5多色實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行檢測(cè)。通過分析產(chǎn)物的熔解曲線來確定擴(kuò)增的特異性,利用2-ΔΔCt法計(jì)算cGK和PAI-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 細(xì)胞總蛋白提取和Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和/或處理24 h后收集細(xì)胞，以蛋白裂解液處理提取總蛋白。利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。40 μg蛋白溶液用于SDS-PAGE，并將蛋白轉(zhuǎn)至固相載體PVDF膜，以5%脫脂牛乳封閉，Ⅰ抗4℃孵育過夜，PBST(含0.5% Tween-20的PBS溶液)漂洗，以1 5 000辣根過氧化物酶標(biāo)Ⅱ抗室溫孵育1 h，利用Immobilon Western HRP底物進(jìn)行目的蛋白檢測(cè)。目的蛋白相對(duì)含量以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin的比值表示。

2.7 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將上述構(gòu)建的含PAI-2基因啟動(dòng)子和亞克隆啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，使用試劑盒中的passive lysis buffer進(jìn)行裂解，通過GloMax 20/20發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的螢光素酶活性，以螢光素酶相對(duì)活性的高低作為啟動(dòng)子活性大小的指標(biāo)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)表示。兩組間差異顯著性分析采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異(LSD)法或Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 cGK過表達(dá)和敲減體系驗(yàn)證

Real-time PCR和Western blot 結(jié)果顯示，cGK過表達(dá)顯著上調(diào)HPASMCs中cGK的mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.01)，合成的3組cGK siRNA均能顯著降低細(xì)胞內(nèi)cGK的mRNA和蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，見圖1。我們挑選敲減效率最為顯著的cGKsiRNA-2進(jìn)行后續(xù)研究。

Figure 1. The over-expression and knock-down ofcGKin the PASMCs. A: the mRNA expression of cGK in the HPASMC; B: protein expression of cGK in the HPASMC. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNC siRNA group;#P<0.05,##P<0.01vspcDNA-NC group.

圖1 過表達(dá)和敲減cGK表達(dá)對(duì)cGK mRNA和蛋白水平的影響

2 cGMP對(duì)PAI-2基因表達(dá)的調(diào)控依賴于cGK

在HPASMCs中BAY 41-2272激活NO-sGC-cGMP信號(hào)通路后，cGK基因的mRNA水平顯著上調(diào)，敲減cGK表達(dá)后，該上調(diào)作用被抑制，見圖2A。在HPASMCs中過表達(dá)和敲減cGK表達(dá)后，PAI-2基因的mRNA表達(dá)也相應(yīng)增加或降低。BAY 41-2272可顯著上調(diào)PAI-2基因的表達(dá)，但加入cGKsiRNA后，該上調(diào)作用明顯受到抑制(P<0.01)。因此，cGMP調(diào)控PAI-2基因表達(dá)依賴于cGK。

3 cGMP通過cGK調(diào)控PAI-2基因啟動(dòng)子活性

為了進(jìn)一步證明cGMP通過cGK調(diào)控PAI-2基因表達(dá)，我們構(gòu)建了PAI-2基因啟動(dòng)子雙螢光素酶報(bào)告基因。過表達(dá)和敲減cGK表達(dá)后，PAI-2基因啟動(dòng)子調(diào)控的螢光素酶相對(duì)活性也相應(yīng)增強(qiáng)和減弱，即PAI-2基因啟動(dòng)子活性相應(yīng)增加和下降；BAY 41-2272處理細(xì)胞后，PAI-2基因啟動(dòng)子活性顯著增加，與上述cGMP對(duì)PAI-2基因表達(dá)調(diào)控結(jié)果一致，見圖3。

Figure 2. cGMP regulated PAI-2 expression dependent on cGK. A: knockdown ofcGKexpression and treatment with BAY41-2272 affec-ted mRNA expression of cGK in the HPASMCs; B: over-expression and knockdown ofcGKexpression, and treatment with BAY41-2272 affected mRNA expression of PAI-2 in the HPASMCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsDMSO group;##P<0.01vsBAY 41-2272 group;△△P<0.01vsNC siRNA group;▲P<0.05vspcDNA-NC group.

圖2 cGMP對(duì)PAI-2基因表達(dá)的調(diào)控依賴于cGK

Figure 3. NO-sGC-cGMP signaling pathway regulated the activity ofPAI-2gene promoter. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNC siRNA+PAI-2-Prom group;#P<0.05vspcDNA-NC+PAI-2-Prom group;△△P<0.01vsDMSO+PAI-2-Prom group.

圖3 NO-sGC-cGMP信號(hào)通路調(diào)控PAI-2基因啟動(dòng)子的活性

4 PAI-2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 000～-800 bp為轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵位點(diǎn)

為了進(jìn)一步找到cGK調(diào)控PAI-2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)域，我們構(gòu)建了PAI-2基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp片段，命名為PAI-2-Prom-WT(-2000-0TSS)(TSS: transcription start site)質(zhì)粒，如圖4A所示依次缺失突變500 bp，分別命名為PAI-2-Prom-M1(-1500-0TSS)、PAI-2-Prom-M2(-1000-0TSS)和PAI-2-Prom-M3(-500-0TSS)質(zhì)粒。在HPASMCs中進(jìn)行雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示PAI-2-Prom-M1和PAI-2-Prom-M2啟動(dòng)子活性明顯增加，PAI-2-Prom-M3啟動(dòng)子活性下降(P<0.01),見圖4B，因此我們推測(cè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)域在PAI-2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 000 bp～-500 bp處。把這一段進(jìn)一步缺失突變，分別命名為PAI-2-Prom-M4(-650-0TSS)和PAI-2-Prom-M5(-800-0TSS)。在HPASMCs中進(jìn)行螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示，與PAI-2-Prom-M1和PAI-2-Prom-M2比較，PAI-2-Prom-M4和PAI-2-Prom-M5啟動(dòng)子活性也明顯下降，并且在BAY 41-2272作用下PAI-2-Prom-M1和PAI-2-Prom-M2的啟動(dòng)活性明顯升高(P<0.01),見圖4C。因此cGK轉(zhuǎn)錄調(diào)控PAI-2基因的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)域在PAI-2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-1 000 bp～-800 bp處，見圖4D。

Figure 4. Dual-luciferase reporter assay. A: the PCR products forPAI-2gene promoter mutants; B and C: dual-luciferase reporter assay; D: schematic diagram of PAI-2 promoter deletion mutations. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsPAI-2-Prom-WT group;&&P<0.01vsPAI-2-Prom-WT without BAY 41-2272 treatment group;##P<0.01vsPAI-2-Prom-WT with BAY 41-2272 treatment group;△P<0.05vsPAI-2-Prom-M1 without BAY 41-2272 treatment group;▲▲P<0.01vsPAI-2-Prom-M2 without BAY 41-2272 treatment group.

圖4 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

討 論

cGMP依賴性途徑的失調(diào)在高血壓和心力衰竭等心血管疾病中發(fā)揮著重要作用[7]。研究NO-sGC-cGMP信號(hào)通路在肺動(dòng)脈高壓的作用近年受到重視。肺血管重構(gòu)是肺動(dòng)脈高壓的一個(gè)主要病理特征，主要因肺血管平滑肌的異常增生而導(dǎo)致血管腔不同程度狹窄。我們前期研究發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓患者外周血細(xì)胞中PAI-2 的mRNA水平顯著降低，并且sGC特異性激活劑西那西呱(cinaciguat)能上調(diào)其mRNA水平[8]。由于PAI-2對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞具有抗增殖、抗遷移和促凋亡的作用，因此我們推測(cè)NO-sGC-cGMP作用于PAI-2從而在肺動(dòng)脈高壓的肺血管重構(gòu)中發(fā)揮作用。

為探究NO-sGC-cGMP信號(hào)通路調(diào)控PAI-2基因表達(dá)的具體分子機(jī)制，本研究對(duì)PAI-2基因啟動(dòng)子活性進(jìn)行檢測(cè)。人PAI-2基因啟動(dòng)子活性由3個(gè)主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控域調(diào)控，即近端核心啟動(dòng)子、上游的沉默子(PAUSE-1，-1977～-1675)和遠(yuǎn)端的反式激活區(qū)(-5 100～-3 300)控制，其中PAUSE-1和反式激活區(qū)的主要活性區(qū)域已被找到[3]，然而近端核心啟動(dòng)子的活性區(qū)域尚不明確。因此，本研究選取包括PAUSE-1在內(nèi)的近端核心啟動(dòng)子序列進(jìn)行研究，探究其主要活性區(qū)域。研究結(jié)果顯示PAI-2啟動(dòng)子的活性在PAI-2-Prom-WT組明顯低于PAI-2-Prom-M1和PAI-2-Prom-M2組，推測(cè)是因?yàn)镻AI-2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-2 000～-1 500包含沉默子PAUSE-1，與文獻(xiàn)報(bào)道相同[3]。進(jìn)一步缺失突變PAI-2啟動(dòng)子后其活性仍在PAI-2-Prom-M1和PAI-2-Prom-M2兩組有上調(diào)，且在PAI-2-Prom-M2組的上調(diào)幅度遠(yuǎn)大于PAI-2-Prom-M1組，而其活性在PAI-2-Prom-M4和PAI-2-Prom-M5兩組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。因此推斷cGK轉(zhuǎn)錄調(diào)控PAI-2基因的關(guān)鍵啟動(dòng)子區(qū)域在PAI-2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)5’側(cè)翼區(qū)的-1 000 bp～-800 bp處。

本研究選用的雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，具有多方面檢測(cè)優(yōu)勢(shì)。首先，雙螢光素酶在宿主細(xì)胞內(nèi)均無(wú)內(nèi)源活性，并且該系統(tǒng)中2個(gè)報(bào)告基因產(chǎn)生的線性檢測(cè)的靈敏度均可達(dá)<10-18mol；其次，該系統(tǒng)以自身作為內(nèi)參，可以在最大程度上減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率等外在因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響；第三，該系統(tǒng)可快速定量檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并且系統(tǒng)在細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶，兩者無(wú)種屬同源性并對(duì)應(yīng)不同的反應(yīng)底物，無(wú)交叉干擾[9-10]。

本研究找到cGK調(diào)控PAI-2啟動(dòng)子活性最強(qiáng)的區(qū)域，并確定該區(qū)域可受cGMP調(diào)控，闡明了NO-sGC-cGMP信號(hào)通路下游新的調(diào)控機(jī)制，為NO-sGC-cGMP信號(hào)通路的作用機(jī)制研究奠定了新的理論基礎(chǔ)。