梅子龍，陳潤(rùn)杰，王 旺，陳 歡，胡 婭，許鵬飛，呂育財(cái)，2，龔大春，2

（1.三峽大學(xué)湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北宜昌 443002；2.三峽大學(xué)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002）

生物酵素產(chǎn)業(yè)是一個(gè)朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)，歸屬于我國(guó)生物產(chǎn)業(yè)和健康產(chǎn)業(yè)，是農(nóng)業(yè)、工業(yè)和服務(wù)業(yè)三產(chǎn)業(yè)融合的大產(chǎn)業(yè)。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來和生活方式的加快，我國(guó)人口的75%處于亞健康狀態(tài)，慢病防控迫在眉睫，酵素產(chǎn)品將在提升健康品質(zhì)、改善亞健康方面發(fā)揮重要作用[1]。目前，我國(guó)植物食用酵素工藝比較單一，大都以自然發(fā)酵為主，產(chǎn)品品質(zhì)不易控制[2]。李建強(qiáng)等人[3]以單一水果和植物綜合果蔬分別為原料，研究了自然發(fā)酵和植入微生物三級(jí)發(fā)酵2種工藝對(duì)酵素產(chǎn)品超氧化物歧化酶（S OD）活性的變化。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中植入酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物菌，對(duì)酵素S OD活性有明顯的提高作用。

我國(guó)木瓜酵素產(chǎn)品研究開發(fā)才剛剛起步，目前以傳統(tǒng)食用木瓜為原料制備酵素的專利報(bào)道只有3項(xiàng)[4-6]，主要以黑曲霉、乳酸菌、酵母菌等為發(fā)酵菌株，采用一次混合，所制備的木瓜酵素具有降血糖、促進(jìn)消化等功效，但以資丘木瓜為原料制備酵素的方法尚不多見。目前，三峽大學(xué)葉汪陽(yáng)和賀海波等人[7-8]最早對(duì)資丘木瓜開展研究，利用硫磺菌接種制備的皺皮木瓜果酵素有較好的降血脂和減肥作用，并采用蜂蜜改進(jìn)了資丘木瓜味酸、澀、硬等感官品質(zhì)的不足。

資丘木瓜是三峽地區(qū)特色種植的藥食兩用植物，長(zhǎng)陽(yáng)土家族自治縣榔坪鎮(zhèn)每年大約種植4 000 km2，加工方式簡(jiǎn)單，除了鮮銷和飲片2種半成品出售方式外，還未進(jìn)入大健康產(chǎn)業(yè)，極大地制約了資丘木瓜種植業(yè)的發(fā)展。因此，試驗(yàn)以長(zhǎng)陽(yáng)資丘木瓜為原料，研究3種不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素品質(zhì)的影響，將對(duì)延長(zhǎng)木瓜產(chǎn)業(yè)鏈、推動(dòng)木瓜種植業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義（目前該方面研究在國(guó)內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與試劑

資丘木瓜（Chaenomelesspeciosa（Sweet）Nakai），長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum），嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus），酵母菌（Saccharomyces cerevisiae），德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus） 等，均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC（China Center of Industrial Culture Collection）。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；蔗糖、乳糖、木糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1） 種子培養(yǎng)基成分。蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L。

（2） 斜面保藏培養(yǎng)基。蔗糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L。

1.1.3 主要儀器

自制1 L酵素發(fā)酵罐、5 L三聯(lián)式發(fā)酵罐；30 L全自動(dòng)滅菌發(fā)酵罐，德國(guó)貝朗公司產(chǎn)品；D HG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技公司產(chǎn)品；SX-700型滅菌鍋、M X-307型冷凍離心機(jī)，上海天美公司產(chǎn)品；U V-1800型分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；LC5090型高效液相，浙江福立公司產(chǎn)品等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 3種發(fā)酵方式及主要流程

以資丘木瓜為主要原料，分別采用自然發(fā)酵（1號(hào)罐）、酵母菌-德氏乳桿菌保加利亞亞種-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵（2號(hào)罐）、酵母菌-長(zhǎng)雙歧桿菌-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵（3號(hào)罐）3種工藝制備木瓜酵素，總時(shí)間為100 d。具體流程如下:

（1） 1號(hào)自然發(fā)酵（1號(hào)罐）。木瓜原料→清洗、消毒→晾干、切片→裝桶、壓緊→加白砂糖→常溫發(fā)酵（60 d）→酵素→過濾→裝瓶→成品。

（2） 2號(hào)接種發(fā)酵（2號(hào)罐）。木瓜原料→清洗、消毒→晾干、切片→裝桶、壓緊→加白砂糖→植入酵母菌→常溫發(fā)酵（30 d）→植入德氏乳桿菌保加利亞亞種→45℃下發(fā)酵（30 d） →植入嗜熱鏈球菌→47℃下發(fā)酵（40 d）→酵素→過濾→裝瓶→成品。

（3）3號(hào)接種發(fā)酵（3號(hào)罐）。木瓜原料→清洗、消毒→晾干→裝桶、壓緊→加白砂糖→植入酵母菌→常溫發(fā)酵（30 d）→植入長(zhǎng)雙歧桿菌→40℃下發(fā)酵（30 d） →植入嗜熱鏈球菌→47℃下發(fā)酵（40 d）→酵素→過濾→裝瓶→成品。

1.2.2 木瓜酵素DPP H·的清除作用[7]

在發(fā)酵過程中進(jìn)行定期取樣，發(fā)酵液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心后，取上清液用于測(cè)定。

準(zhǔn)確稱取20 mg DPP H·，用無水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為80μg/mL的DPP H·溶液，將酵素樣品用離心除去固體物質(zhì)。取1 mL測(cè)試液及1 mL的質(zhì)量濃度為80μg/mL DPP H·混勻后避光反應(yīng)30 min，定容至5 mL。于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度的變化，對(duì)照溶劑用無水乙醇代替，DPP H·清除率的計(jì)算公式:

式中:A1——1 mL DPP H·液與1 mL提取液的吸光度；

A2——1 mL提取液與1 mL無水乙醇的吸光度；

A3——1 mL DPP H·液與1 mL無水乙醇的吸光度。

1.2.3 木瓜酵素清除O2-·能力的測(cè)定[8]

取pH值8.2的Tris-HCL緩沖液4.5 mL，分別加入4.2 mL蒸餾水和濃度為25 mmol/L鄰苯三酚0.3 mL，混勻后于25℃條件下反應(yīng)5 min，立即加入1 mL濃度為8 mol/L的HCl溶液，終止反應(yīng)，定容至25 mL。于波長(zhǎng)299 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得A1；另取緩沖液4.5 mL，蒸餾水定容至25 mL，于波長(zhǎng)299 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得A2；另取緩沖液4.5 mL，加入酵素測(cè)試液1 mL，蒸餾水3.2 mL，鄰苯三酚溶液0.3 mL，混勻后于25℃條件下反應(yīng)5 min，立即加入1 mL濃度為8 mol/L的HCL溶液，終止反應(yīng)，定容至25 mL。于波長(zhǎng)299 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得A3。同上步操作，但是不加鄰苯三酚溶液，測(cè)得A4。O2-·清除率的計(jì)算公式:

1.2.4 木瓜酵素清除·O H能力的測(cè)定[9]

在比色管中依次加入濃度為6 mmol/L FeS O4溶液2 mL，酵素測(cè)試液1 mL，蒸餾水1 mL，濃度為6 mmol/LH2O2溶液2 mL，搖勻后靜置10 min，再加入濃度為6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻靜置30 min后稀釋1倍，再于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度A1；用蒸餾水代替水楊酸溶液，測(cè)得吸光度A2；用蒸餾水代替酵素測(cè)試液，測(cè)得吸光度A3?！ H清除率計(jì)算公式:

1.2.5 酵素中自由基清除能力總評(píng)價(jià)

將3種自由基清除能力進(jìn)行求和，然后平均，即可得到酵素的自由基清除能力綜合評(píng)價(jià)值R%=（R1+R2+R3）/3.

1.2.6 蛋白酶活性的測(cè)定[10]

采用GB/T 23527—2009的福林法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 纖維素酶活性的測(cè)定[11]

采用GB/T 2583—2003的還原糖法測(cè)定。

1.2.8 脂肪酶活性的測(cè)定

采用GB/T 23535—2009的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9 淀粉酶活性的測(cè)定

采用張思《16種市售酵素食品功能分析與評(píng)價(jià)》中的方法進(jìn)行測(cè)量。

1.2.10 總酸的測(cè)定

采用GB/T 12456—2008的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.11 有機(jī)酸的測(cè)定[12]

樣品處理:取一定量體積的酵素原液，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，取上清液，適當(dāng)稀釋，過0.22μm水膜，待用。

色譜條件:色譜柱Aminex H PX-87H（300 mm×7.8 mm），檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速0.6 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵方式對(duì)所制得的木瓜酵素DPP H·清除能力的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室初步試驗(yàn)，建立了1.2.1所示的3種發(fā)酵方式，制備出木瓜酵素，每隔5 d進(jìn)行1次清除自由能力的測(cè)定。

不同發(fā)酵方式對(duì)木瓜酵素DPP H·清除能力的影響見圖1。

由圖1可知，1號(hào)自然發(fā)酵工藝所制得的木瓜酵素隨著自然發(fā)酵過程的進(jìn)行，DPP H·清除率略有提高；而人工2號(hào)和3號(hào)發(fā)酵工藝在接種酵母菌和德氏乳桿菌后，DPP H·清除率變化緩慢，而接種嗜熱鏈球菌后DPP H·清除率均增加30%左右，和自然發(fā)酵DPP H·清除率基本持平。

圖1 不同發(fā)酵方式對(duì)木瓜酵素DPP H·清除能力的影響

2.2 不同發(fā)酵方式對(duì)所制得的木瓜酵素O2-·的清除能力的影響

不同發(fā)酵方式對(duì)資丘木瓜酵素O2-·清除能力的影響見圖2。

圖2 不同發(fā)酵方式對(duì)資丘木瓜酵素O2-·清除能力的影響

由圖2可知，1號(hào)自然發(fā)酵工藝制備的木瓜酵素對(duì)O2-·清除能力比較穩(wěn)定，增加不多，但比人工接種2號(hào)、3號(hào)發(fā)酵工藝的清除率高5%左右，2號(hào)發(fā)酵工藝接種德氏乳桿菌后的O2-·清除能力先增后降，在接種嗜熱鏈球菌后的O2-·清除能力增加較快，增加10%左右，最后趨于穩(wěn)定，而3號(hào)發(fā)酵工藝接種雙歧桿菌后相對(duì)穩(wěn)定，基本和自然發(fā)酵的清除O2-·能力持平。從酵素制備工藝控制角度自然發(fā)酵和3號(hào)發(fā)酵工藝優(yōu)于2號(hào)發(fā)酵工藝。

2.3 不同發(fā)酵方式對(duì)所制得的資丘木瓜酵素·O H的清除能力的影響

不同發(fā)酵方式對(duì)資丘木瓜酵素·O H清除能力的影響見圖3。

由圖3可知，3種發(fā)酵工藝所制得的資丘木瓜酵素在·O H清除能力相差不大，1號(hào)自然發(fā)酵所得到的酵素清除·O H能力略高，且相對(duì)穩(wěn)定，而3號(hào)發(fā)酵工藝的·O H清除率下降20%左右。

2.4 3種發(fā)酵工藝對(duì)所制得的木瓜酵素的自由基清除能力的總評(píng)價(jià)

圖3 不同發(fā)酵方式對(duì)資丘木瓜酵素·O H清除能力的影響

研究表明，通過3種發(fā)酵工藝試驗(yàn)，所制得的木瓜酵素對(duì)DPP H·、O2-·、·O H 3種離子的清除能力有一定差異。

不同發(fā)酵方式對(duì)木瓜酵素清除自由基總能力的影響見圖4。

圖4 不同發(fā)酵方式對(duì)木瓜酵素清除自由基總能力的影響

由圖4可知，在100 d時(shí)，人工接種的發(fā)酵工藝所制得的酵素綜合清除自由基率比自然發(fā)酵的要低5%左右。這與一般植物酵素的接種有些區(qū)別，說明木瓜酵素制備還是以自然發(fā)酵在清除自由基能力方面效果最好。

2.5 不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素淀粉酶活力的影響

不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素產(chǎn)品中淀粉酶活力影響見圖5。

圖5 不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素產(chǎn)品中淀粉酶活力影響

自然發(fā)酵的淀粉酶活力逐漸增加，而接種發(fā)酵工藝的淀粉酶活力基本不變，在100 d，自然發(fā)酵的淀粉酶活力最高，大約是人工接種的2號(hào)和3號(hào)發(fā)酵工藝的3倍。說明自然發(fā)酵有利于木瓜酵素中淀粉酶的積累。

2.6 不同發(fā)酵工藝木瓜酵素中總酸含量和有機(jī)酸種類的比較

不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素產(chǎn)品總酸含量的影響見圖6。

圖6 不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素產(chǎn)品總酸含量的影響

由圖6可知，不同發(fā)酵工藝中酵素的總酸含量存在明顯的差異，其總酸含量大小依次為1號(hào)自然發(fā)酵＞3號(hào)接種發(fā)酵＞2號(hào)接種發(fā)酵。其中，自然發(fā)酵的1號(hào)工藝總酸最高可達(dá)6.45 g/kg，說明自然發(fā)酵的微生物菌群產(chǎn)酸能力強(qiáng)，但人工接種發(fā)酵可以增加乙酸含量，豐富酸的種類。

2.7 不同發(fā)酵工藝對(duì)資丘木瓜酵素活菌數(shù)的影響

酵素品質(zhì)高低一個(gè)重要指標(biāo)是益生菌數(shù)量。通過不同發(fā)酵方式得到的資丘木瓜酵素活菌數(shù)差別較大。在自然發(fā)酵中，容易受環(huán)境影響較大，活菌數(shù)先增后減，2號(hào)發(fā)酵工藝也是這個(gè)趨勢(shì)。而3號(hào)發(fā)酵工藝的活菌數(shù)一直保持增長(zhǎng)，最高可以達(dá)到7×107，是自然發(fā)酵2倍多，這對(duì)于改善腸道微生物具有重要意義。

不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素產(chǎn)品活菌數(shù)的影響見圖7。

圖7 不同發(fā)酵工藝對(duì)木瓜酵素產(chǎn)品活菌數(shù)的影響

3 結(jié)論

以藥食兩用的資丘木瓜為主要原料，采用自然發(fā)酵、酵母菌-德氏乳桿菌保加利亞亞種-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵、酵母菌-長(zhǎng)雙歧桿菌-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵3種工藝制備木瓜酵素，并對(duì)其發(fā)酵過程中的3種清除自由基能力、淀粉酶和有機(jī)酸進(jìn)行研究。研究表明不同發(fā)酵工藝制得的木瓜酵素均有較強(qiáng)的抗氧化性，對(duì)自由基的清除率在80%以上，其中自然發(fā)酵制備的酵素清除自由基清除能力更強(qiáng)，工藝相對(duì)穩(wěn)定，人工接種嗜熱鏈球菌后可以提高木瓜酵素清除DPP H·和O2-·的能力，分別提高30%和10%；自然發(fā)酵的淀粉酶活力最高，比人工接種的2號(hào)和3號(hào)發(fā)酵工藝提高約2倍，有機(jī)酸含量也最高，但人工接種發(fā)酵工藝所制得酵素產(chǎn)品活菌數(shù)比自然發(fā)酵的高，其中3號(hào)發(fā)酵工藝所得酵素產(chǎn)品的益生菌數(shù)量是自然發(fā)酵2倍多，有機(jī)酸中增加了乙酸種類。后期對(duì)自然發(fā)酵的菌群分布有待進(jìn)一步研究。