李曉華，黃粵，馬婷婷，皮婷，姚家成，夏珍珍，馮喆，溫馨

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/微生物資源與利用湖北省工程技術(shù)研究中心，武漢 430074)

稻瘟病菌是一種能讓多種草本植物發(fā)生病變的病原真菌，水稻等多種農(nóng)作物會受其感染[1].稻瘟病每年都給我國的水稻產(chǎn)量帶來相當(dāng)大的損失[2].稻瘟病菌幾乎不分季節(jié)地侵害水稻，危害時(shí)間長，侵染部位多，感染病狀也極為多樣.稻瘟病菌菌絲和孢子主要在染病的植物體上越冬，次年又繼續(xù)感染第二年的作物，稻瘟病菌的孢子還可以借助空氣傳播，是一種頑固的農(nóng)作物病害真菌.在傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)病害防治中，化學(xué)農(nóng)藥防治稻瘟病一直是主要手段，但長時(shí)間大劑量地使用化學(xué)農(nóng)藥帶來生態(tài)環(huán)境破壞等負(fù)面影響[3,4].生物防治逐漸成為農(nóng)作物病害防治的一種重要手段，農(nóng)用抗生素具有對人、畜、禽和非目標(biāo)生物安全低毒，對環(huán)境破壞小，易分解等優(yōu)點(diǎn)，在生物防治農(nóng)作物病害中扮演著重要的角色[5].

本實(shí)驗(yàn)室從湖北省神農(nóng)架地區(qū)土壤中分離得到一株具有抗稻瘟病菌活性的微生物，以稻瘟病菌NO-1為指示菌，用瓊脂擴(kuò)散法和杯碟法測定該菌株次級代謝產(chǎn)物對稻瘟病菌NO-1的抑菌活性，研究其發(fā)酵特性，分析其發(fā)酵液特性，利用PCR技術(shù)克隆attB序列，對attB序列進(jìn)行分析，為抗稻瘟病菌微生物的利用奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料

土壤樣品從湖北省神農(nóng)架地區(qū)煙草種植地采樣，裝入無菌袋中，對微生物進(jìn)行分離．指示菌稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)NO-1菌株由本實(shí)驗(yàn)室保藏.

1.2 菌株分離

稱取10 g 土樣置于含90 mL無菌水的三角瓶中，于30 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)2 h，10倍稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的土壤懸液，分別涂布在含有不同濃度重鉻酸鉀的高氏I號培養(yǎng)基上，在30 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4 d，經(jīng)過多次挑單菌純化后，收集孢子至20%甘油中，-20 ℃保存．

1.3 菌種鑒定

對篩選到的菌種進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和生理生化鑒定[9]，提取菌株總DNA[9]，采用通用引物F1( 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和F2 ( 5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′) 進(jìn)行擴(kuò)增. PCR反應(yīng)體系: 10 ×PCR Buffer 1.5 μL，模板DNA 1.0 μL，dNTP 1.0 μL，一對引物各1.0 μL，Taq酶0.5 μL，用超純水定容至15.0 μL. 擴(kuò)增條件: 94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min. 測序結(jié)果通過Blast在GenBank 基因庫中與相關(guān)菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比對分析. 利用MEGA7.0對ⅠT2菌株的16S rDNA基因序列比對構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(采取N-J法，bootstrap value為1000) ．

1.4 ⅠT2菌株的抑菌活性測定

利用杯碟法[11]測定放線菌ⅠT2菌株發(fā)酵液的抑菌活性，瓊脂擴(kuò)散法[9]測定ⅠT2菌株菌塊的抑菌活性，十字測量法測量抑菌圈直徑.

1.5 ⅠT2菌株attB位點(diǎn)克隆與分析

以ⅠT2菌株的總DNA為模板，以噬菌體ΦC31的attB位點(diǎn)保守序列設(shè)計(jì)的一對引物[12]attB1:5′-CGGATCCGACCC(G/C)TTCA-CATGATGGAC-3′，attB2:5′-TGGAATTCAGGTT(G/C)ACCCA(C/G)AGCTG(G/C)AG-3′擴(kuò)增ⅠT2菌株的attB位點(diǎn)序列，PCR擴(kuò)增條件: 95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性45 s，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸2 min，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸7 min. 測序結(jié)果通過Blast在GenBank基因庫中比對分析．

2 結(jié)果和分析

2.1 ⅠT2菌株的分離鑒定

以植物病原真菌稻瘟病菌NO-1菌株為指示菌，取培養(yǎng)120 h的ⅠT2菌株菌塊，檢測其抗稻瘟病活性，結(jié)果如圖1所示.

A～D)ⅠT2菌株菌塊；E)瓊脂塊圖1 ⅠT2菌株對稻瘟病NO-1菌株的抑菌活性Fig.1 Antifungal activity of ⅠT2 strain against Pyricularia oryzae NO-1

ⅠT2菌株菌塊對稻瘟病菌NO-1菌株的抑菌圈平均直徑為29.7 mm，表明ⅠT2菌株對稻瘟病菌NO-1菌株具有較強(qiáng)的抑菌活性.

將ⅠT2菌株接種于高氏I號培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)120 h后，基內(nèi)菌絲和氣生菌絲生長良好，呈灰白色.ⅠT2菌株革蘭氏染色呈陽性，淀粉水解為陽性，甲基紅試驗(yàn)為陰性；不產(chǎn)生H2S；能利用葡萄糖、乳糖、蔗糖和甘露醇.

以ⅠT2菌株總DNA為模板擴(kuò)增ⅠT2菌株16S rDNA序列并測序，ⅠT2菌株16S rDNA序列長度為1348 bp. 采用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇N-J法，設(shè)置Bootstrap值為1000，結(jié)果如圖2所示，ⅠT2菌株16S rDNA序列與來源于Streptomycesclaviferstrain KAR51的16S rDNA序列具有99%同源性，初步鑒定ⅠT2菌株屬于鏈霉菌屬.

雖然大事記的收錄標(biāo)準(zhǔn)和編寫規(guī)定在志書編纂規(guī)則中有明確規(guī)定，但編者面對志書中的各種實(shí)際問題，具體的收錄與刪增是以編者對事情的認(rèn)識和編纂水平?jīng)Q定的，所以，編者一方面要熟悉各種標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，一方面要通讀全志，內(nèi)心要有正確的衡量標(biāo)準(zhǔn)，小心斟酌、細(xì)心思考，對資料要注意保存?zhèn)洳椋瑢?nèi)容要進(jìn)行前后反復(fù)核對修定，以使全志的時(shí)間及相關(guān)資料前后統(tǒng)一。

圖2 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

2.2 不同發(fā)酵條件對鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間

將5 mL的鏈霉菌ⅠT2菌株種子液接種至200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)168 h，每隔24 h取一次樣，使用杯碟法檢測其發(fā)酵液的抑菌活性. 測定不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液的抑菌圈直徑，結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液的抑菌活性的影響Fig.3 Effect of different cultured time on the antifungal activity of Streptomyces sp.ⅠT2 strain

在24～48 h的時(shí)間范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨時(shí)間增加而增大，在48～168 h的時(shí)間范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨時(shí)間增加而減小，表明鏈霉菌ⅠT2菌株具有較高的抑菌活性的發(fā)酵時(shí)間為48 h.

2.2.2 發(fā)酵轉(zhuǎn)速

將5 mL的鏈霉菌ⅠT2菌株種子液接種至200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)溫度下，分別設(shè)置發(fā)酵轉(zhuǎn)速為120、150、180、200、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，使用杯碟法檢測其發(fā)酵液的抑菌活性，測定不同發(fā)酵轉(zhuǎn)速的發(fā)酵液的抑菌圈直徑，結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同發(fā)酵轉(zhuǎn)速對鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液的抑菌活性的影響Fig.4 Effect of different rotate speed on the antifungal activity of Streptomyces sp.ⅠT2 strain

在120～150 r/min的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨轉(zhuǎn)速的增加而增加；在150～220 r/min的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨轉(zhuǎn)速增加而減小，表明鏈霉菌ⅠT2菌株具有較高的抑菌活性的發(fā)酵轉(zhuǎn)速為150 r/min.

2.2.3 發(fā)酵溫度

將5 mL的鏈霉菌ⅠT2菌株種子液接種至200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別設(shè)置發(fā)酵溫度為23、26.5、30、33.5、37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，使用杯碟法檢測其發(fā)酵液的抑菌活性. 測定不同發(fā)酵溫度的發(fā)酵液的抑菌圈直徑，結(jié)果如圖5所示，在23～26.5 ℃的溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨溫度的增加而增加；在26.5～30 ℃的溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑大小隨溫度的增加無明顯影響；在30～37 ℃的溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨溫度的增加而減少，表明鏈霉菌ⅠT2菌株具有較高的抑菌活性的發(fā)酵溫度為26.5～30 ℃.

2.3 鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液的穩(wěn)定性

2.3.1 熱穩(wěn)定性

將5 mL的鏈霉菌ⅠT2菌株種子液接種至200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于26.5 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后，取相同體積的發(fā)酵液，分別置于20、37、55、80、100 ℃水浴1 h，使用杯碟法檢測其發(fā)酵液的抑菌活性. 測定不同溫度處理的發(fā)酵液的抑菌圈直徑，結(jié)果如圖6所示，在20～55 ℃的溫度范圍內(nèi)，隨溫度的增加，發(fā)酵液抑菌圈直徑大小無明顯變化；在55～100 ℃的溫度范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨溫度的增加而減少至0 mm，表明在20～55 ℃的溫度范圍內(nèi)，鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液具有較好的熱穩(wěn)定性.

2.3.2 酸堿穩(wěn)定性

取于26.5 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d后的鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液，測定其pH值. 將發(fā)酵液pH值分別調(diào)整到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.7、9.0、10.0、11.0，室溫放置12 h后將pH調(diào)至7.7，以未處理的發(fā)酵液為對照，使用杯碟法檢測其發(fā)酵液的抑菌活性. 測定不同溫度處理的發(fā)酵液的抑菌圈直徑，結(jié)果如圖7所示，在1.0～2.0的pH范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨pH值的增加而增大；在2.0～7.7的pH范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑大小無明顯變化；在7.7～11.0的pH范圍內(nèi)，發(fā)酵液抑菌圈直徑隨pH值的增加而減少至0 mm，表明在2.0～7.7的pH范圍內(nèi)，鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液具有較好的穩(wěn)定性.

圖7 鏈霉菌ⅠT2菌株發(fā)酵液的酸堿穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of fermentation broth of Streptomyces sp. ⅠT2 strain

2.4 鏈霉菌ⅠT2菌株的attB位點(diǎn)的克隆與分析

以鏈霉菌ⅠT2菌株的總DNA為模板，用噬菌體ΦC31 的attB位點(diǎn)保守序列設(shè)計(jì)的一對引物attB1和attB2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條大小為270 bp的DNA片段(圖8). 對擴(kuò)增的片段進(jìn)行回收、測序，鏈霉菌ⅠT2菌株的attB 位點(diǎn)序列長277 bp．

M)DL2000 Maker；A)鏈霉菌ⅠT2菌株attB位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖8 鏈霉菌ⅠT2菌株attB位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.8 The amplification of attB site of Streptomyces sp.ⅠT2 strain

利用NCBI數(shù)據(jù)庫對attB位點(diǎn)序列進(jìn)行在線比對分析，結(jié)果如圖9所示，鏈霉菌ⅠT2菌株的attB位點(diǎn)核心序列與多種鏈霉菌和小單孢菌的attB序列相似，與S.griseusM095的attB位點(diǎn)核心區(qū)域的序列相似度最高，達(dá)到97%，整個(gè)序列核心區(qū)高度保守，僅有少數(shù)的幾個(gè)堿基發(fā)生變化.研究表明，來源于鏈霉菌噬菌體的ΦC31的整合酶基因與attP位點(diǎn)可與鏈霉菌基因組上的attB位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，進(jìn)而整合到宿主基因組中，獲得穩(wěn)定的遺傳特性[12]，同時(shí)研究表明發(fā)生交換的核心序列為5′-TT[13]，鏈霉菌ⅠT2菌株的attB序列同樣含有關(guān)鍵的5′-TT序列.

圖9 鏈霉菌ⅠT2菌株attB位點(diǎn)序列與其他鏈霉菌和小單孢菌的對比Fig.9 Aligement of sequence of attB sites in Streptomyces sp.ⅠT2 strain and various species of Streptomyces and Micromonospora rosaria

2.5 鏈霉菌ⅠT2菌株與質(zhì)粒pSET152之間位點(diǎn)特異性重組

質(zhì)粒pSET152含有阿泊拉霉素抗性基因. 將制備好的受體ⅠT2菌株菌絲體與供體大腸桿菌混合，涂布于接合轉(zhuǎn)移平板上，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 h后用抗生素覆蓋培養(yǎng)基的表面，于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，獲得阿泊拉霉素抗性接合轉(zhuǎn)移子. 提取總DNA，以一對驗(yàn)證引物attL-F、attL-R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到一條長度為353 bp的特異性片段(圖10)，在鏈霉菌ⅠT2菌株中無法擴(kuò)增得到這個(gè)特異性片段，在鏈霉菌ⅠT2菌株接合轉(zhuǎn)移子中可擴(kuò)增得到這個(gè)片段，表明質(zhì)粒pSET152 通過attP位點(diǎn)與鏈霉菌ⅠT2菌株的染色體上的attB位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組．

M) DL2000 Marker； 1) 鏈霉菌ⅠT2菌株野生菌株；2) 鏈霉菌ⅠT2菌株接合轉(zhuǎn)移子圖10 鏈霉菌ⅠT2菌株接合轉(zhuǎn)移子的驗(yàn)證Fig.10 Verification for apomycin-resistant conjugation transfer of Streptomyces sp. I T2 strain

3 結(jié)語

天然產(chǎn)物具有豐富的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生化特性，具備發(fā)現(xiàn)新型抗菌生物活性成分的巨大潛力[14].本研究以稻瘟病菌NO-1菌株為指示菌，對從神農(nóng)架地區(qū)土壤中篩選出的1株鏈霉菌ⅠT2菌株進(jìn)行了初步研究. 該菌株的瓊脂菌塊對稻瘟病菌NO-1菌株有良好的抑菌活性，抑菌圈平均直徑為29.7 mm；經(jīng)16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，初步鑒定ⅠT2菌株為鏈霉菌屬；測定不同培養(yǎng)條件對該菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響，結(jié)果表明鏈霉菌ⅠT2菌株較適合的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度為26.5～30 ℃，發(fā)酵轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵時(shí)間為48 h. 在該發(fā)酵條件下發(fā)酵液的抑菌活性較好，對稻瘟病菌NO-1菌株的抑菌圈直徑達(dá)到了42.0 mm以上；利用PCR擴(kuò)增獲得了鏈霉菌ⅠT2菌株的attB位點(diǎn)序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析，該序列含有發(fā)生位點(diǎn)特異性重組所必須的核心位點(diǎn)5′-TT序列，同時(shí)利用pSET152質(zhì)粒與鏈霉菌ⅠT2菌株進(jìn)行鏈霉菌-大腸桿菌屬間接合轉(zhuǎn)移，獲得了具有穩(wěn)定的阿泊拉霉素抗性的鏈霉菌ⅠT2菌株接合轉(zhuǎn)移子，表明質(zhì)粒pSET152通過attP 位點(diǎn)與鏈霉菌ⅠT2 菌株的染色體上的attB 位點(diǎn)發(fā)生了位點(diǎn)特異性重組．