程國軍，羅莎，謝婧，吳和濤

(中南民族大學 生命科學學院/微生物資源與利用湖北省工程技術研究中心,武漢 430074)

根瘤菌是一類革蘭氏陰性土壤細菌.可以與特定的宿主植物共生形成結瘤，并將空氣中的分子氮轉化為植物可以使用的氨態(tài)氮，是能與豆科植物結瘤的共生固氮細菌的總稱. 一般來說，根瘤菌被分為6個屬，皆屬于α-變形桿菌[1]. 根瘤菌積極參與細胞外信號傳導至宿主豆科植物的過程，以引發(fā)感染和根瘤形態(tài)發(fā)生. 根瘤菌也可利用N-?；呓z氨酸內酯信號進行群體感應基因調控，增強與豆科植物的相互作用和在脅迫下的存活[2].

前期對豌豆根瘤菌3841的轉錄組的生物信息學分析研究發(fā)現(xiàn)，tpaA基因是編碼RND外排泵轉運蛋白的基因. 細菌的外排泵主要有5個家族，分別是易化子超家族(MFS 家族)、ABC轉運家族、小型多藥防御家族(SMR家族)、防御結瘤分裂家族(RND家族即RND外排泵) 和多藥有毒化合物排出家族(MATE家族)[3]. 基因組分析和微陣列分析表明：主動外排是細菌內在耐藥性的主要機制，而RND外排泵是一種與抗生素外排直接相關的外排泵，幾乎所有的這類外排泵都與耐藥性有關[4,5]. 革蘭氏陰性細菌比陽性細菌對抗生素顯示出更強的耐受性，RND外排泵的過量表達是革蘭陰性菌細菌抗生素耐藥性形成的重要原因之一[6]. 革蘭氏陰性菌RND外排泵主要由3部分組成，分別是在細胞內膜上的轉運蛋白即RND內膜外排轉運蛋白(RND efflux transporters)、細胞周質膜融合蛋白(MFP)和細胞外膜上的孔道外排蛋白(OMF)[7]. 其中，RND內膜外排轉運蛋白負責細菌細胞膜上和周質空間藥物的結合和轉運. RND外排泵系統(tǒng)對許多抗生素具有外排作用，主要與細胞內膜的轉運蛋白有關[8]，所以缺少其中任一部分在細菌對藥進行外排的過程中，都將會導致其耐藥性能的喪失[9]. 研究編碼外排泵系統(tǒng)蛋白的相關基因在根瘤菌共生固氮中的作用機制、并分析根瘤菌中RND外排泵功能以及其與耐藥性和致病性的關系，對于揭示根瘤菌的耐藥機制，降低致病性具有重要的指導意義.

R.leguminosarum3841tpaA基因編碼RND家族內膜外排轉運蛋白，在對tpaA基因進行生物信息學分析的基礎上，通過構建R.leguminosarum3841tpaA基因突變株，研究tpaA基因突變對根瘤菌生長、抗生素耐藥性以及根瘤共生的影響，為深入闡明RND家族內膜外排轉運蛋白在根瘤菌中的作用機制奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 菌株質粒和培養(yǎng)基

豌豆根瘤菌R.leguminosarumbv.Viciae3841、突變體構建載體pk19mob由英國牛津大學Philip S Poole教授提供. 根瘤菌培養(yǎng)基為TY天然培養(yǎng)基或AMS基本培養(yǎng)基，大腸桿菌為LB培養(yǎng)基.抗生素均購于Sigma公司，其中篩選和培養(yǎng)大腸桿菌所用抗生素及濃度：卡那霉素(Km)20 μg/mL; 四環(huán)素(Tc)5 μg/ mL. 篩選和培養(yǎng)根瘤菌所用抗生素及濃度：四環(huán)素(Tc)2g/mL，鏈霉素(Str) 500g/mL，新霉素(Neo) 80g/mL. 實驗所用的菌株與質粒見表1.

表1 實驗所用的菌株與質粒Tab.1 The strains and plasmids used in this paper

1.2 主要試劑

限制性內切酶(XbaⅠ、BamHⅠ、Hind Ⅲ等)、T4 DNA連接酶、RNAiso Plus(TaKaRa)；Phusion 高保真酶、TaqDNA 聚合酶(Thermo Scientific)；反轉錄試劑盒為PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master (Rox)；PCR產物回收試劑盒以及DNA凝膠回收試劑盒(博大泰克公司).

1.3 R. leguminosarum tpaA 突變體的構建

參照田夢洋等[10]方法構建豌豆根瘤菌tpaA基因突變體，抽提豌豆根瘤菌3841總DNA，以R.leguminosarum3841總DNA為模板，以tpaAUP/tpaALW為PCR引物擴增得到tpaA基因片段. 研究所用PCR引物如表2.

表2 PCR引物序列
Tab.2 Sequences of the PCR primers

(5′→3′)tpaAUPAAA TCT AGA TGA GAT TAT ATC AGG GTC TGtpaALWAAA GGA TCC ACG ATG CTG GCA AGC TTG GTtpaAMapAGA TCC GTC TGC TTG AAG GTpK19AATC AGA TCT TGA TCC CCT GCpK19BGCA CGA GGG AGC TTC CAG GGQtpaAUPAGGAATACGACCGGCAGCTCQtpaALWGAGATCGAGATTGGCCTGAGgyrB1UPGGC ATC ACC AAA AGG GAA AAgyrB1LWGCG AGG AGA ATT TCG GAT CA

注：下劃線為限制性酶切位點

將擴增得到的目的片段與載體pK19mob分別用XbaⅠ和BamH Ⅰ雙酶切，酶切產物經T4 DNA連接酶連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞. 轉化子質粒經酶切和PCR驗證正確后，獲得tpaA基因突變體構建質粒pKtpaA. 以R.leguminosarum3841為受體菌，含pRK2013質粒的大腸桿菌為輔助菌，含pKtpaA質粒的大腸桿菌為供體菌進行三親本雜交，獲得的轉移接合子，通過抗性篩選后用引物tpaAMap/pK19A或 tpaAMap/pK19B對接合子進行PCR驗證，篩選tpaA基因突變株RLtpaA.

1.4 菌株生長實驗

將野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpa接種到含相應抗生素的TY斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后用AMS液體培養(yǎng)基洗脫，重懸接種到AMS液體培養(yǎng)基或TY液體培養(yǎng)基中，初始OD600為0.01，在30 ℃，200 r/min的恒溫震蕩搖床中培養(yǎng)，定時測OD600. 包括下面各項實驗在內，所有菌株實驗均3組重復.

1.5 抗生素抗性實驗

將野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpaA接種到含相應抗生素的TY培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)1 d后用3 mL不含抗生素的TY液體培養(yǎng)基洗脫，取10 μL 103CFU菌液點樣在分別含有鏈霉素(750g/mL，500g/mL，250g/mL)、氯霉素(5g/mL)、四環(huán)素(1g/mL)、壯觀霉素(5g/mL)、氨芐青霉素(10g/mL,50g/mL,100g/mL)的TY培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計突變體和野生型菌落的生長情況[11].

1.6 接種植株共生固氮酶活的測定

采用無菌蛭石種植甜豌豆[12]. 將消毒后的豌豆種子播種于已滅菌的蛭石燒杯內，再分別接種野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpaA菌液，每顆豌豆上接種1 mL菌液. 播種完成后用保鮮膜封口，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周后挑破幼苗上的保鮮膜，并定期澆灌營養(yǎng)液，4周后用乙炔還原法測定根瘤固氮酶活性.

1.7 qRT-PCR分析tpaA基因在根瘤中的表達

野生型3841菌株接種豌豆植株，培養(yǎng)25 d后采集豌豆植株，采用Trizol法提取類菌體總RNA，反轉錄成cDNA. 以AMS培養(yǎng)的對數(shù)期3841菌株為對照，對類菌體中的tpaA基因進行熒光定量PCR分析. qRT-PCR引物見表2，gyrB1基因為內參.

2 結果與分析

2.1 豌豆根瘤菌3841 tpaA生物信息學分析

在NCBI上通過基因序列分析發(fā)現(xiàn)豌豆根瘤菌3841tpaA基因編碼RND家族內膜外排轉運蛋白(圖1)，含有399個氨基酸. RND外排泵 (resistance-nodulation-cell division family)即耐藥節(jié)結化細胞分化家族，能夠從胞內和細胞周質中捕獲底物并有效地排到胞外，減少抗生素在菌體內積聚[13]. 細菌中幾乎所有RND類外排泵都與耐藥性相關，其中，革蘭陰性菌的耐藥性主要由RND外排泵引起[14].

圖1 豌豆根瘤菌3841中TpaA蛋白結構域分析Fig.1 Analysis of the protein domains of TpaA in R. leguminosarum 3841

2.2 豌豆根瘤菌tpaA突變菌株的構建

以豌豆根瘤菌3841為受體菌，含pRK2013質粒的大腸桿菌菌株為輔助菌，含pKtpaA質粒的大腸桿菌為供體菌進行三親本雜交后，通過抗性篩選及用引物tpaAMap/pK19A或tpaAMap/pK19B為引物對接合子進行PCR驗證后表明，tpaA基因突變株RLtpaA構建成功.

2.3 tpaA基因突變對菌株生長的影響

活化的RLtpaA菌株與野生型3841菌株生長實驗表明(圖2, 3)，在AMS基本培養(yǎng)基中，前20 h野生型3841菌株比突變體RLtpaA菌株生長更快，表明tpaA基因突變會使豌豆根瘤菌延遲生長. 而在TY天然培養(yǎng)基中，野生型3841菌株和突變體RLtpaA菌株生長變化趨勢相同，tpaA基因突變不影響豌豆根瘤菌在天然培養(yǎng)基中的正常生長(圖3).

圖2 AMS培養(yǎng)基中3841與RLtpaA菌株的生長情況Fig.2 The growth of 3841 and RLtpaA in AMS medium

圖3 TY培養(yǎng)基中3841與RLtpaA的生長情況Fig.3 The growth of 3841 and RLtpaA in TY medium

2.4 tpaA基因突變對根瘤菌抗生素抗性的影響

將活化的野生型豌豆根瘤菌3841和突變體菌株RLtpaA在分別含有不同濃度的多種抗生素的TY培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，在選擇性抗生素培養(yǎng)基中野生型菌株3841比突變體菌株RLtpaA表現(xiàn)出了更強的抗生素抗性(表3)，由于RND家族外排泵的表達是革蘭陰性菌細菌抗生素耐藥性形成的重要原因之一，表明tpaA基因突變可能會抑制根瘤菌中的RND家族外排泵的表達，從而降低其抗生素耐藥性.

表3 根瘤菌菌株對抗生素的敏感性Tab.3 The sensitivity of Rhizobium strains to antibiotics

注：+++,++,+ 表示生長狀況良好、一般、不好

2.5 豌豆盆栽實驗

盆栽4周后，接種了tpaA基因突變株RLtpaA的豌豆植株形成紅色有效根瘤. 將接種根瘤菌的豌豆植株利用乙炔還原法測定根瘤固氮酶活性，突變株接種植株比野生型接種植株的固氮酶活性減少了10.5% (圖4)，表明tpaA基因突變對根瘤菌的固氮酶活性有一定的影響.

圖4 豌豆根瘤菌3841和突變菌株RLtpaA的固氮酶活性Fig.4 The symbiotic nitrogenase activity of RLtpaA and 3841

2.6 tpaA基因在根瘤類菌體中的表達

熒光定量RT-PCR分析tpaA基因在根瘤類菌體中的表達量，結果表明在形成25 d根瘤類菌體中表達量為在自生條件下的2.37±0.29倍. 統(tǒng)計分析表明，tpaA基因的表達達到顯著差異(P<0.05)，說明tpaA基因的表達受根瘤共生環(huán)境的誘導.

3 討論

抗生素耐藥性一直是細菌性疾病防治中的一個難題.細菌的外排泵可以增強細菌耐抗生素的能力， 而外排泵的過量表達是細菌耐藥性形成的重要機制之一. RND多耐藥外排泵對革蘭氏陰性細菌耐藥性貢獻很大，在大腸桿菌和銅綠假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的以耐藥結節(jié)分化家族為代表的多耐藥外排泵成為人們關注的焦點[15].

tpaA基因編碼RND外排泵轉運蛋白，該基因突變會使根瘤菌在基本AMS培養(yǎng)基生長延遲，但不影響其在天然培養(yǎng)基TY中的正常生長. 說明失去該基因之后，細菌生長受到了部分抑制，這可能是因為菌株生長到一定階段后，細胞內通過代謝產生的不利產物不能通過轉運排出體外，從而影響菌體生長繁殖.tpaA基因突變株接種豌豆植株能形成紅色有效根瘤，但其固氮酶活酶減少了10.5%，表明tpaA基因突變對根瘤菌的共生酶活有一定的影響. Takeshima等[16]發(fā)現(xiàn)用染料木黃酮處理大豆根瘤菌后，外排泵基因受到誘導表達明顯上調. 本研究也表明tpaA基因在根瘤類菌體中的表達顯著上調且顯著差異. Eda等[17].通過調控寄主植物中抑菌化合物的分泌，證明了苜蓿根瘤菌主要外排系統(tǒng)SmeAB對結瘤競爭力起到了重要作用野生型菌株3841比突變體菌株RLtpaA表現(xiàn)出更強的抗生素抗性. 由于RND家族外排泵的表達是革蘭氏陰性菌抗生素耐藥性形成的重要原因之一，表明tpaA基因突變可能會抑制根瘤菌中的RND家族外排泵的表達，從而使得其抗生素耐藥性降低. 已有研究發(fā)現(xiàn)RND外排泵引起銅綠假單胞菌耐藥性及影響其致病性.雖然細菌外排泵的研究歷史較長，但根瘤菌中外排泵的報道較少，外排泵系統(tǒng)相關基因在根瘤菌共生固氮中的作用機制值得深入研究.