薛璐, 歐陽聰, 孫寧遠(yuǎn), 秦緒慧

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)研究所，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實驗室，武漢430074)

胎盤特異蛋白9(Plac9)是典型的在人胚4～6周低豐度表達(dá)，而之后3周內(nèi)表達(dá)量有明顯上升的新基因[1].它定位于人染色體10q22.3上，其cDNA含有典型的kozak序列，完整的開放閱讀框，全長691 bp，編碼91個氨基酸，分子量約為10 kb的含信號肽的蛋白[2].Plac9是新發(fā)現(xiàn)的基因，其功能尚不清楚，根據(jù)生物信息學(xué)分析預(yù)測Plac9蛋白與胚胎的骨骼發(fā)育、軟骨生成以及膠原蛋白合成有關(guān)[1].CRISPR/Cas9基于細(xì)菌保護(hù)自身免受病毒感染的系統(tǒng)衍生而來，在細(xì)菌[3]、斑馬魚[4]、大鼠[5]及人類細(xì)胞[6]中均表現(xiàn)出較強(qiáng)的基因組編輯活性.CRISPR最早發(fā)現(xiàn)于原核生物大腸桿菌基因組的串聯(lián)重復(fù)序列，隨后Rodolphe Barrangou等證明這種串聯(lián)重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，說明它們參與了細(xì)菌和古細(xì)菌抵御外來噬菌體的入侵[7].CRISPR/Cas系統(tǒng)對DNA序列的特異性切割依賴于CAS和crRNA形成的蛋白核酸復(fù)合物對DNA序列上PAM區(qū)域的識別，利用這一特性可將其作為人工核酸內(nèi)切酶(EEN),用以對基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行遺傳修飾，實現(xiàn)基因組編輯[8].本文通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)用流式細(xì)胞術(shù)分選技術(shù)構(gòu)建Plac9敲除細(xì)胞系，進(jìn)一步研究該基因的功能.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人胚腎細(xì)胞株293T(武漢大學(xué)細(xì)胞庫)；PX458質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)菌Stbl3、10XT4 Ligation Buffer、T4連接酶(武漢淼靈生物)；T4 PNK, 10XTaq Buffer, dNTP, rTaq酶(TaKaRa)；Fast Digest BpiI, Fast AP, 10X Fast Digest Buffer(Thermo Scientific)；DTT(Biosharp)；Endo-free Plasmid Mini Kite(Omega)；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(AxyGen)；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS(HyClone)；血清(BioCell)；雙抗、胰酶、Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、PMSF、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、Tween-20、BeyoECL Plus、Loading buffe(碧云天)；Protein Ladder(Thermo)；CH3OH(分析醇)；NaCl, Gly, KH2PO4, Na2HPO4·12H2O, CaCl2(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑)；Anti-plac9(Cell Signaling Technology)；Anti-β-Actin, HRP-goat anti mouse IgG, HRP-goat anti rabbit IgG(康為世紀(jì))；引物合成、基因測序(武漢擎科生物).

1.2 sgRNA寡核苷酸鏈序列的設(shè)計

利用CRISPR在線設(shè)計工具網(wǎng)站http://crispr.mit.edu/，根據(jù)評分系統(tǒng)，分別在Plac9的外顯子設(shè)計4個sgRNA(S1,S2,S3,S4).選擇得分較高的序列，去掉PAM序列堿基，若第一個堿基不是G，則需要在前面補(bǔ)一個G，以sgRNA序列為模板，設(shè)計其互補(bǔ)鏈，再在其兩端加上酶切位點(diǎn)即分別在編碼鏈模板5′端添加CACCg，非編碼鏈模板5′端添加AAAC，3′端添加C，設(shè)計的sgRNA序列見表1. 載體PX458和目的基因Plac9的結(jié)構(gòu)圖見圖1.

表1 Plac9 sgRNA引物序列Tab.1 Prime sequences of Plac9 sgRNA

A) PX458質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，有2個Bbs I酶切位點(diǎn)；B) sgRNA-S1的靶向識別位置及其周圍的DNA序列圖1 構(gòu)建靶向Plac9的PX458質(zhì)粒Fig.1 Construction of Plac9-targeting PX458 plasmids

1.3 PX458-sgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用Fast DigestBpiI酶切質(zhì)粒PX458，使其線性化，切膠回收后測其濃度.將sgRNA寡核苷酸鏈退火為雙鏈，再與線性化的PX458連接，轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)中，挑取陽性單克隆菌落，將菌液進(jìn)行菌落PCR，再將有正確條帶的菌落送測序驗證是否構(gòu)建成功.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞用DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)在含5%的CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中.轉(zhuǎn)染前24 h取對數(shù)期細(xì)胞以5×105個/孔的細(xì)胞密度接種到6孔板中培養(yǎng)24 h[9].提前2 h將6孔板中的培養(yǎng)基換成opti-MEM饑餓細(xì)胞，將2.5 μg質(zhì)粒加入到125 μL的opti-MEM中，8 μL的lipo-2000加入到125 μL的opti-MEM中，靜置5 min后，將它們輕輕混合，再靜置30 min后加入到細(xì)胞中，3 h后換完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.

1.5 流式細(xì)胞儀分選

將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞用胰酶消化，用PBS洗2次后，過流式膜，將細(xì)胞放在流式管中，流式管預(yù)先放入3 mL含10%血清的PBS，準(zhǔn)備好上機(jī)分選.選擇single模式，根據(jù)陰性對照調(diào)節(jié)電壓，設(shè)置陽性門后，開始將帶有綠色熒光的細(xì)胞單個打至含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基的96孔板中[10].

1.6 單細(xì)胞培養(yǎng)

將篩選出來的細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)約15 d后轉(zhuǎn)至24孔板中，待細(xì)胞密度長至80%再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入12孔板中，再轉(zhuǎn)至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng).

1.7 測序檢測

收取6孔板中的細(xì)胞提基因組測序.篩選出編輯過的細(xì)胞系，將該細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存1批，進(jìn)行后續(xù)實驗.

1.8 Western blot檢測敲除效率

將測序結(jié)果正確的細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，用普通未做轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞為對照，檢測Plac9的蛋白表達(dá)量.先用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配分離膠和濃縮膠，插上梳子；再點(diǎn)樣濃縮膠30 mA、80 V跑40 min，分離膠30 mA、100 V跑1 h.電泳完畢后，取出玻璃板，剝得分離膠，作好標(biāo)記，將分離膠和膜按順序放在轉(zhuǎn)膜板上，輕輕趕出氣泡，200 mA、100 V轉(zhuǎn)膜1 h.再用5%的脫脂奶粉將轉(zhuǎn)好的膜封閉1 h，用PBST洗1次后，加入1抗，4 ℃過夜.接著用PBST洗3次，每次10 min，室溫下敷2抗1 h，PBST洗3次，每次10 min，最后ECL顯影觀察結(jié)果.

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒載體的檢測結(jié)果

將單核苷酸序列退火連成雙鏈后與線性化的PX458連接，轉(zhuǎn)化到stbl3感受態(tài)中，挑取陽性單克隆菌液，做菌落PCR后，將有正確條帶的菌液送測序.測序結(jié)果顯示，sg-RNAS1, S2, S3, S4分別正確插入到PX458載體中.

2.2 lipo2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果

將構(gòu)建好的載體用lipo2000轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，48 h后用汞燈觀察其轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果見圖2.由圖2可知，PX458和PX458-sgRNA-S1這兩個質(zhì)粒都成功轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中.

A) 明場下視野(10×); B) 熒光下視野(10×)圖2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞Fig.2 Plasmid transfected 293T cells

2.3 構(gòu)建敲除Plac9基因的293T細(xì)胞株

將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀篩選出單個帶綠色熒光的細(xì)胞至96孔板中，培養(yǎng)后將細(xì)胞提基因組送測序檢測是否有編輯過的細(xì)胞株，測序結(jié)果顯示僅有PX458-H5對細(xì)胞進(jìn)行了編輯，并用DNA MAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果如圖3.由圖3可知：在方框處的堿基發(fā)生了編輯，并出現(xiàn)了明顯的套峰，說明該基因已經(jīng)被編輯了.

圖3 PX458-sgRNA-S1的測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of PX458-sgRNA-S1

為進(jìn)一步驗證該細(xì)胞是否被編輯成功，實驗運(yùn)用錯配酶進(jìn)行驗證，結(jié)果如圖4.由圖4可知：P為陽性對照，S為檢測的樣品(PX458-sgRNA-S1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞后，提取該細(xì)胞的基因組)，PX458為陰性對照.陽性對照和檢測的樣品均被錯配酶切開，對照組未被切開.

圖4 PX458-sgRNA-S1錯配酶驗證Fig.4 Mismatched enzyme verification of PX458-sgRNA-S1

2.4 Western blot結(jié)果

將篩選出來進(jìn)行編輯過的細(xì)胞株提蛋白，以正常293T細(xì)胞為對照，觀察Plac9的蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖5.由圖5可知，編輯過的293T細(xì)胞中Plac9蛋白的表達(dá)量明顯少于未編輯的293T細(xì)胞.

圖5 Western blot 檢測PX458-S1的靶向敲除效果Fig.5 Targeted knock out effect of PX458-S1 by Western blot

3 討論

基因編輯技術(shù)是研究基因功能的重要手段，早期的基因編輯技術(shù)大部分通過同源重組的方法對目的基因進(jìn)行編輯，但編輯效率很低；而后出現(xiàn)了人工核酸酶技術(shù)，比如鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)[11]和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)[12]，它們是通過DNA蛋白對靶點(diǎn)進(jìn)行特異性識別，可設(shè)計結(jié)合任意基因組中DNA序列的模塊化蛋白，對特定的DNA序列進(jìn)行識別和編輯.CRISPR/Cas9系統(tǒng)是利用sgRNA識別特定的DNA序列，介導(dǎo)Cas9蛋白對靶點(diǎn)序列進(jìn)行編輯，這種方法更加簡潔、高效.

利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建敲除細(xì)胞系一般需要用病毒作轉(zhuǎn)染以提高轉(zhuǎn)染效率，再用嘌磷霉素篩選細(xì)胞，用有限稀釋法將篩好的細(xì)胞分為單個細(xì)胞培養(yǎng)；但使用病毒具有一定的安全隱患，本文先將sgRNA與PX458載體相連接構(gòu)成表達(dá)載體，用lipo2000作轉(zhuǎn)染，使轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞帶有綠色熒光，再通過流式細(xì)胞儀將帶綠色熒光的細(xì)胞分選為單克隆，培養(yǎng)好后提基因組測序，篩選出編輯過的細(xì)胞，再進(jìn)行后續(xù)實驗.這種方法避免了用病毒作轉(zhuǎn)染，克服了轉(zhuǎn)染效率不高的問題，不用有限稀釋，省時、方便、高效.

Plac9基因是在人胚胎基因組中發(fā)現(xiàn)的在人胚4～6周低豐度表達(dá)，在7～9周高表達(dá)的一個新的基因[1]，該基因功能尚未研究清楚，但它在7～9周對胚胎發(fā)育有著一定的作用.根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測可知，Plac9基因與胚胎的骨骼發(fā)育、軟骨生成及膠原蛋白合成有關(guān).本實驗成功構(gòu)建了Plac9基因敲除細(xì)胞系，可進(jìn)一步深入地研究Plac9基因相關(guān)功能.