王明軍，毛秋粉，劉金彪，王寧，汲權(quán)威，侯永強，王新征

河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，1甲狀腺外科，2核醫(yī)學(xué)科，河南 洛陽 471003

甲狀腺癌是頭頸部及內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，多見于女性。據(jù)統(tǒng)計，近年來甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[1-2]。近年來，生物治療及分子檢測技術(shù)的發(fā)展使多種疾病的診療步入新臺階，腫瘤早期檢測技術(shù)不斷發(fā)展，尋找甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制具有重要意義。斯鈣素1（stanniocalcin 1，STC1）位于染色體8p11.2-p21，是一種糖蛋白激素，在人體的多種組織及各個臟器中均表達，以旁分泌或自分泌形式參與血管生成、妊娠等多種生理過程[3]。研究顯示，甲狀腺癌、腎癌、乳腺癌組織中STC1的表達水平均高于正常組織，STC1可能是一種新型的腫瘤標志物[4-6]。在肺癌細胞中，通過RNA干擾抑制STC1的表達可抑制腫瘤細胞的增殖，阻滯細胞周期，并促進腫瘤細胞凋亡[7]。研究表明，甲狀腺癌中STC1的高表達與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]，然而關(guān)于STC1與甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學(xué)特性的關(guān)系尚未清楚。本研究通過RNA干擾技術(shù)抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細胞中STC1的表達，并檢測細胞的增殖和凋亡情況，研究其可能的分子機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料方法

1.1 細胞及主要試劑和儀器

甲狀腺乳頭狀癌K1細胞購自中國科學(xué)院上海細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、OPTI-MEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；CCK8細胞增殖試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒及流式細胞儀均購自美國BD公司；STC1、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）、磷酸化的AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗體均購自美國Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自上海鈺博生物科技有限公司。酶標儀購自美國Bio Tek公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌K1細胞，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取生長至對數(shù)期的細胞。將甲狀腺乳頭狀癌K1細胞分為空白對照組、陰性對照組和STC1-siRNA組，陰性對照組和STC1-siRNA組分別為轉(zhuǎn)染NC-siRNA和STC1-siRNA的細胞，空白對照組為未轉(zhuǎn)染的細胞。

1.3 siRNA的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染

實驗前1天使用含血清無雙抗培養(yǎng)基鋪6孔板，細胞密度為6×105/孔，待細胞達60%融合度時開始轉(zhuǎn)染。取1.5 ml的EP管，加入50 μl OPTIMEM培養(yǎng)基，再加入5 μl STC1-siRNA或NC-siRNA，室溫中靜置5 min，制備成A溶液。另取1.5 ml的EP 管，加入 50 μl OPTI-MEM，再加入 2 μl LipofectamineTM2000，室溫中靜置5 min，制備成B溶液。輕輕混合A液和B液，室溫中靜置20 min。將混合液加入已含OPTI-MEM的6孔細胞培養(yǎng)板中，輕輕混合均勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，換為含血清無雙抗的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法檢測STC 1蛋白及Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白表達

收集轉(zhuǎn)染48 h的3組細胞，采用BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定，100℃水浴10 min，取等量的變性蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，洗膜后采用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃孵育一抗（1∶1000稀釋的STC1、Bcl-2、BAX、AKT、p-AKT及內(nèi)參GAPDH抗體）過夜，次日去除一抗，洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（1∶1000），37℃孵育45 min，洗膜，置于暗室中，應(yīng)用蛋白熒光檢測試劑盒在X光片上顯示結(jié)果。

1.5 CCK 8檢測細胞增殖

將生長至對數(shù)期的甲狀腺乳頭狀癌K1細胞，3000 r/min離心10 min，棄上清液，制備成細胞懸液，以5×103/100 μl鋪至96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h以進行同步化處理，按照1.3中的方法將siRNA轉(zhuǎn)染細胞，每組設(shè)置5個復(fù)孔，并設(shè)置空白對照，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72 h收集細胞，每孔中加入CCK8溶液10 μl，37 ℃孵育4 h?？瞻讓φ湛渍{(diào)零，置于酶標儀上測定490 nm處的光密度（optical density，OD）值。實驗重復(fù)3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組細胞，應(yīng)用結(jié)合緩沖液重懸細胞，將細胞濃度調(diào)整為1×106/ml，在離心管中加入細胞懸液100 μ（l約含有1×105個細胞），再分別加入Annexin V-FITC和PI各5 μl，輕輕混合均勻，置于避光環(huán)境中常溫（25℃）孵育15 min，再在各組細胞中加入結(jié)合緩沖液400 μl，1 h內(nèi)應(yīng)用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.7 ROS水平檢測

收集轉(zhuǎn)染48 h后的3組細胞，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細胞，加入含有20 μmol/L 2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯的PBS，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液洗滌細胞，重懸細胞后，應(yīng)用流式細胞儀檢測激發(fā)波長為488 nm和發(fā)射波長為525 nm處各組細胞的熒光強度。以熒光強度反映細胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）水平。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STC 1蛋白表達水平的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，空白對照組、陰性對照組和STC1-siRNA組中STC1蛋白的相對表達量分別為（0.452±0.049）、（0.478±0.054）、（0.106±0.011），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.380，P＜0.01）。陰性對照組和空白對照組中STC1蛋白的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；STC1-siRNA組中STC1蛋白的相對表達量明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.953，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot檢測甲狀腺乳頭狀癌K 1細胞中STC 1蛋白的表達情況

2.2 細胞增殖活性的比較

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，空白對照組、陰性對照組和STC1-siRNA組細胞的OD值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，STC1-siRNA組細胞的OD值均明顯低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同時間點各組細胞OD值的比較

2.3 細胞凋亡率的比較

轉(zhuǎn)染48 h后，空白對照組、陰性對照組和STC1-siRNA組細胞的凋亡率分別為（3.11±0.62）%、（3.18±0.65）%和（16.66±1.54）%，3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=172.401，P＜0.01）。STC1-siRNA組細胞的凋亡率明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.123，P＜0.01）。（圖2）

圖2 流式細胞儀檢測甲狀腺乳頭狀癌K 1細胞的凋亡情況

2.4 ROS水平的比較

空白對照組、陰性對照組和STC1-siRNA組細胞的 ROS水平分別為（105.8±8.9）、（107.7±9.2）和（146.8±10.3），3組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.856，P＜0.01）。STC1-siRNA組細胞的ROS水平明顯高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.294，P＜0.01）。

2.5 Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白表達水平的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，空白對照組、陰性對照組和STC1-siRNA組中Bcl-2、BAX、p-AKT蛋白的相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；空白對照組、陰性對照組和STC1-siRNA組中AKT蛋白的相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。STC1-siRNA組中Bcl-2、p-AKT蛋白的相對表達量均明顯低于空白對照組，BAX蛋白的相對表達量明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表2、圖3）

表2 3組細胞中Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白相對表達量的比較

圖2 Western blot檢測甲狀腺乳頭狀癌K 1細胞中Bcl- 2、BAX、AKT和p-AKT蛋白的表達情況

3 討論

在研究甲狀腺乳頭狀癌的分子機制中發(fā)現(xiàn)，核因子κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）、磷脂酰肌醇 3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/AKT、WNT/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha，HIF-1α）等多種信號通路參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展[9-11]。本研究中的STC1基因與上述多種信號通路有密切聯(lián)系。STC1最早被發(fā)現(xiàn)于硬骨魚的內(nèi)分泌腺，是一種可調(diào)節(jié)鈣磷代謝的糖蛋白激素，多種腫瘤中出現(xiàn)STC1表達的升高，其與患者的臨床分期、病理分級及預(yù)后有密切關(guān)系[12-13]。研究顯示，子宮頸癌中STC1可通過激活NF-κB信號通路抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力[14]；肺腺癌中STC1可通過激活JNK和ERK信號通路誘導(dǎo)Bcl-2和BclxL等抗凋亡蛋白的表達，同時抑制BAK、BAX和BID等促凋亡蛋白的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡[15]。提示STC1可能成為新的治療甲狀腺乳頭狀癌的靶點。

RNA干擾是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的使mRNA序列降解的現(xiàn)象，是近年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的基因阻斷技術(shù)，具有高效性、特異性等特點，是研究基因功能的有效途徑[16-17]。本研究中將STC1-siRNA轉(zhuǎn)染至甲狀腺乳頭狀癌細胞，通過CCK8及流式細胞術(shù)分別檢測細胞的增殖和凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24、48、72 h后細胞的增殖活力均下降，轉(zhuǎn)染48 h后，細胞的凋亡率升高。甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展涉及多方面，Bcl-2基因家族是細胞凋亡過程中重要的執(zhí)行因子，Bcl-2和BAX基因均屬于Bcl-2基因家族，其中Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用，而BAX發(fā)揮促凋亡作用，兩者具有拮抗作用，在調(diào)控細胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。細胞的生存狀態(tài)與ROS的累積程度有關(guān)，適量的ROS累積可促進腫瘤細胞的存活，而過度的ROS累積可導(dǎo)致細胞的氧化應(yīng)激損傷甚至細胞死亡[19]。研究顯示，甲狀腺乳頭狀癌中ROS水平升高與細胞凋亡密切相關(guān)[20]。PI3K/AKT是一條重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細胞的生長、凋亡、分化、血管生成等過程[21]。PI3K/AKT信號通路被激活后，AKT發(fā)生磷酸化，作用于下游的多個靶點，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌中PI3K/AKT信號通路被激活，磷酸化的AKT表達升高，可促進腫瘤細胞生長，抑制腫瘤細胞凋亡，抑制該信號通路后作用相反[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制甲狀腺乳頭狀癌中STC1的表達可導(dǎo)致BAX和ROS的表達水平升高，Bcl-2和p-AKT的表達水平下降。說明抑制STC1的表達可抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞中的AKT信號通路，使抗凋亡基因的表達下調(diào)，促凋亡基因的表達上調(diào)。

綜上所述，抑制甲狀腺乳頭狀癌中STC1基因的表達可降低腫瘤細胞的增殖活力，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，其作用機制可能與下調(diào)AKT信號通路有關(guān)。本研究提示STC1可能是甲狀腺乳頭狀癌分子診斷及治療的新靶點，但目前關(guān)于STC1在甲狀腺乳頭狀癌中的研究并不多，本研究也只在細胞水平分析了STC1的作用及可能的分子機制，還需更多的實驗數(shù)據(jù)及體內(nèi)研究進一步證實。