賈志陽，周志剛，李帥，王猛

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院影像與核醫(yī)學(xué)病區(qū)，鄭州 450052

食管癌是中國最常見的消化道惡性腫瘤之一，2015年關(guān)于中國人群癌癥發(fā)病率的統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，在過去10年中國人群食管癌發(fā)病及病死例數(shù)均呈升高和年輕化趨勢，病死率在惡性腫瘤中高居第二位[1]。食管癌發(fā)病早期常難以發(fā)覺，當(dāng)出現(xiàn)進食困難、聲音嘶啞等一系列臨床癥狀時常已發(fā)展至中晚期，總體治療效果欠佳，因此尋找快速有效的食管癌早期診斷及預(yù)后評估生物學(xué)指標(biāo)是目前的研究熱點[2]。既往研究表明，多項生理及病理學(xué)因素共同參與了食管癌的發(fā)生發(fā)展過程，其中與食管癌療效及預(yù)后關(guān)系最密切的兩個生物學(xué)特征為腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，而腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移過程與新生血管的生成緊密相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）為組織血管和淋巴生成的重要調(diào)控因子，主要在大腸癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤中高度表達(dá)[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在食管癌的生長、進展和轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮了重要作用，VEGF表達(dá)水平是影響患者療效及預(yù)后的重要指標(biāo)[4]。乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）是一種抑癌基因，參與了DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及基因轉(zhuǎn)錄等多個過程。田云霄等[5]研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1陽性表達(dá)與食管鱗癌不良預(yù)后密切相關(guān)，可能成為食管癌預(yù)后評估的新生物學(xué)指標(biāo)。但目前關(guān)于VEGF、BRCA1在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系的研究仍較少?；谝陨涎芯勘尘埃狙芯繑M對110例食管癌患者術(shù)后標(biāo)本進行VEGF和BRCA1陽性表達(dá)率檢測，旨在分析VEGF和BRCA1在食管鱗癌患者中的陽性表達(dá)情況，并進一步探索二者在評估食管鱗癌患者預(yù)后中的臨床價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2012年1月至2015年1月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行食管癌切除術(shù)的110例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查證實為食管鱗癌；②患者術(shù)前均未行放療、化療或免疫治療；③認(rèn)知能力正常，同意后續(xù)隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往無其他部位腫瘤病史。110例食管鱗癌患者中，男66例，女44例；年齡為50～75歲，平均（62.18±15.50）歲。留取食管鱗癌患者的食管癌切除組織標(biāo)本作為食管鱗癌組，另取相應(yīng)的癌旁正常黏膜組織標(biāo)本（據(jù)腫瘤5 cm以上的食管組織）作為癌旁正常黏膜組；另取58例食管高級上皮內(nèi)瘤變患者的組織標(biāo)本作為食管上皮內(nèi)瘤變組，58例患者中男31例，女27例，年齡為55～75歲，平均（64.21±18.72）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究方案經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者均了解研究目的并簽訂知情同意書，擁有隨時退出的權(quán)力。

1.2 免疫組織化學(xué)染色方法

所有組織標(biāo)本均先用10%甲醛溶液固定，常規(guī)進行脫水和石蠟包埋后，4 μm厚連續(xù)切片，并行常規(guī)蘇木精-伊紅染色及病理學(xué)檢測。

免疫組織化學(xué)染色方法：選取8張石蠟切片進行脫蠟及抗原修復(fù)，然后分別用3%H2O2和正常山羊血清封閉50 min，封閉結(jié)束后，將其中4張組織切片滴入抗VEGF特異性抗體（1∶500稀釋），4℃下孵育24 h；另4張組織切片滴入抗BRCA1特異性抗體（1∶500稀釋），4℃下孵育24 h；孵育完成后采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗3次，滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃下孵育40 min后，PBS連續(xù)漂洗3次（＞5 min）；滴加鏈霉卵白素和辣根酶標(biāo)記生物素復(fù)合物，37℃下孵育40 min后，PBS連續(xù)漂洗3次（＞5 min）；滴加二氨基聯(lián)苯胺顯色液，常溫下顯色3～5 min，并用PBS替代一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

每張石蠟切片隨機選取10個高倍視野，然后每視野計數(shù)200個細(xì)胞，BRCA1和VEGF陽性染色為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)淺黃色至棕褐色顆粒，觀察細(xì)胞質(zhì)染色強度及陽性細(xì)胞百分比并進行計分。染色強度：未著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分比：＜10%為0分，10%～50%為1分，51%～75%為2分，＞75%為3分；根據(jù)兩項評分乘積計算總分，總分≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.4 隨訪

對患者采用電話、微信預(yù)約的方式進行門診隨訪，以患者確診為食管鱗癌的時間為起點，隨訪截止日期為2017年5月。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

將實驗室及隨訪數(shù)據(jù)錄入Epidata 3.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，并采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman相關(guān)性分析分析BRCA1與VEGF的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存情況的比較采用Breslow檢驗；影響因素分析采用Cox風(fēng)險模型。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRCA 1、VEGF陽性表達(dá)情況的比較

食管鱗癌組組織中BRCA1、VEGF陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜組和食管上皮內(nèi)瘤變組，食管上皮內(nèi)瘤變組組織中BRCA1陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常黏膜組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；癌旁正常黏膜組和食管上皮內(nèi)瘤變組組織中VEGF陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同組織中BRCA1和VEGF陽性表達(dá)情況的比較[n（%）

2.2 BRCA 1與VEGF在食管鱗癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

BRCA1與VEGF在食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率分別為78.18%和82.73%，經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，BRCA1與VEGF在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.341，P＜0.01）。

2.3 BRCA 1及VEGF的表達(dá)與食管鱗癌患者生存情況的關(guān)系

110例食管鱗癌患者隨訪時間9～60個月，中位隨訪時間36個月。86例BRCA1陽性表達(dá)患者中41例死亡，死亡患者生存期為9～60個月；24例BRCA1陰性表達(dá)患者中6例死亡，死亡患者生存期為12～52個月；BRCA1陰性表達(dá)患者生存情況優(yōu)于陽性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.424，P＜0.05）（圖1）。91例VEGF陽性表達(dá)患者中43例死亡，死亡患者生存期為9～60個月；19例VEGF陰性表達(dá)患者中4例死亡，死亡患者生存期為20～48個月；VEGF陰性表達(dá)患者生存情況優(yōu)于陽性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.127，P＜0.05）（圖2）。

圖1 BRCA 1陽性表達(dá)（n=86）及陰性表達(dá)（n=24）食管鱗癌患者的生存曲線

圖2 VEGF陽性表達(dá)（n=91）及陰性表達(dá)（n=19）食管鱗癌患者的生存曲線

2.4 BRCA 1、VEGF的表達(dá)情況與食管鱗癌臨床特征的關(guān)系

不同TNM分期、分化程度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者BRCA1陽性表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=24.018、23.529、44.869，P＜0.05）；不同年齡、性別、浸潤深度、腫瘤最大徑及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者BRCA1陽性表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同TNM分期、分化程度、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的食管鱗癌患者VEGF陽性表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.730、19.875、6.055、8.967、12.283，P＜0.05）；不同年齡、性別及腫瘤最大徑的食管鱗癌患者VEGF陽性表達(dá)情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 BRCA 1、VEGF的表達(dá)情況與食管鱗癌臨床特征的關(guān)系

2.5 食管鱗癌患者預(yù)后影響因素的Cox風(fēng)險模型分析

將患者性別、年齡、腫瘤最大徑、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期及BRCA1、VEGF表達(dá)納入Cox回歸分析模型，單因素分析結(jié)果顯示與食管鱗癌患者預(yù)后有關(guān)的因素有5個：分化程度（HR=2.342，95%CI：1.114～4.923）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（HR=2.427，95%CI：1.051～5.605）、TNM分期（HR=1.536，95%CI：1.279～4.607）、BRCA1表達(dá)（HR=1.902，95%CI：1.018～3.554）和 VEGF表達(dá)（HR=2.338，95%CI：1.157～4.725）。將上述 5個因素再次納入Cox回歸分析模型，多因素分析結(jié)果顯示，分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及VEGF表達(dá)是影響食管癌患者預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.01）。（表3）

表3 食管癌患者預(yù)后影響因素的多因素分析

3 討論

目前，臨床上食管癌的治療手段包括手術(shù)切除、放療、化療及免疫治療，但總體治療效果欠佳[6]。流行病學(xué)研究得出，行食管癌根治術(shù)的患者5年生存率僅為36.02%，其中，治療效果較差的主要原因是腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[7]。近10年來，多種生物學(xué)指標(biāo)的發(fā)現(xiàn)對食管癌早期診斷及預(yù)后評估具有重要意義，如研究發(fā)現(xiàn)VEGF、BRCA1、基質(zhì)金屬蛋白酶家族等可成為食管癌患者早期診斷、腫瘤侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，為食管癌的診斷及治療提供更多新的思路[8]。

腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成，以提供細(xì)胞生長所必需的葡萄糖及氧氣。研究證實，腫瘤患者體內(nèi)存在多種血管生成因子，其中VEGF是最有效的一種，其主要通過與特異性受體相結(jié)合，誘導(dǎo)下游信號通路釋放多種細(xì)胞因子及生長因子，進而調(diào)控新生血管的形成，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移。近年來多項國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中VEGF存在異常高表達(dá)，且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及浸潤深度具有明顯的相關(guān)性[9-10]。本研究結(jié)果提示，VEGF在食管鱗癌患者中陽性表達(dá)率為82.73%，明顯高于癌旁正常黏膜組織及食管上皮內(nèi)瘤變組織，表明VEGF在食管鱗癌患者的診斷中具有重要的臨床價值。此外，研究還發(fā)現(xiàn)VEGF的表達(dá)與食管鱗癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及浸潤深度有關(guān)（P＜0.05），而與患者年齡、性別及腫瘤最大徑無關(guān)（P＞0.05），這與Chen等[11]研究結(jié)果相似，其發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中VEGF表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及腫瘤組織微血管密度有關(guān)。另外，在VEGF陰性表達(dá)和陽性表達(dá)患者的長期隨訪中發(fā)現(xiàn)，VEGF陰性表達(dá)患者生存情況優(yōu)于陽性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Cox回歸分析模型則發(fā)現(xiàn)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及VEGF表達(dá)是影響食管鱗癌預(yù)后的獨立危險因素。上述研究結(jié)果可能為評估食管鱗癌患者療效及生存期提供重要的參考依據(jù)。吳旻等[12]也研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α及VEGF高表達(dá)可能對放療效果及生存預(yù)后有影響。于振濤等[13]則發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子1α能夠促進VEGF基因轉(zhuǎn)錄，增強VEGFmRNA異常表達(dá)，從而促進腫瘤異常新生血管形成，這可能成為VEGF高表達(dá)的機制之一。

BRCA1基因是乳腺癌及卵巢癌易感基因，常被看作基因組守護者。其定位于17號染色體長臂21染色體區(qū)間，參與了DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及中心體復(fù)制等多個環(huán)節(jié)，對人體基因組穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。目前，BRCA1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究較廣，但在食管鱗癌患者中的表達(dá)及作用研究仍存在不足。Zhao等[14]的動物實驗證實，與非食管腫瘤組織相比，食管癌組織中BRCA1蛋白表達(dá)增加，且BRCA1蛋白高表達(dá)可促進小鼠腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，減少存活時間。另有學(xué)者臨床研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為88.6%，且BRCA1高表達(dá)者預(yù)后較差[15]。本研究中采取免疫組織化學(xué)法檢測了110例食管鱗癌組織及癌旁正常黏膜組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)食管鱗癌組織中BRCA1陽性表達(dá)率可達(dá)78.18%，明顯高于癌旁正常黏膜組織（26.36%）和食管上皮內(nèi)瘤變組織（46.55%）。此外，還探討了BRCA1表達(dá)與食管鱗癌臨床特征的關(guān)系及對生存的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BRCA1陽性表達(dá)與食管鱗癌患者TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05），與患者年齡、性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤深度及腫瘤最大徑無關(guān)（P＞0.05），且BRCA1陰性表達(dá)患者生存情況優(yōu)于陽性表達(dá)患者。這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相似[16-17]。由此推測，BRCA1在不同類型食管黏膜組織中陽性表達(dá)率不同可能與某種機制效應(yīng)導(dǎo)致BRCA1基因突變有關(guān)，而這種突變可能導(dǎo)致食管黏膜的化生甚至惡變。既往研究認(rèn)為，BRCA1基因突變多發(fā)生在氨基末端的環(huán)指結(jié)構(gòu)域及羧基末端的BRCT結(jié)構(gòu)域，這兩個功能結(jié)構(gòu)域生物學(xué)上高度保守，一旦突變可導(dǎo)致BRCA1從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的一系列錯位表達(dá)，促使BRCA1在食管癌進展中扮演類似致癌基因的角色[18]。

本研究也發(fā)現(xiàn)，在食管癌患者預(yù)后影響因素的Cox回歸分析中，BRCA1表達(dá)并不是影響患者預(yù)后的因素，表明BRCA1可能在食管癌進展中與某些細(xì)胞因子或生長因子發(fā)揮協(xié)同或拮抗作用。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示，BRCA1與VEGF在食管癌組織中的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明兩者在食管癌發(fā)生發(fā)展中可能起協(xié)同作用。目前國內(nèi)外關(guān)于BRCA1基因與VEGF基因的關(guān)系研究報道仍較少。Kawai等[19]發(fā)現(xiàn)BRCA1基因可抑制VEGF表達(dá)促進新生血管的形成，而一旦BRCA1基因失去正常表達(dá)，VEGF基因可出現(xiàn)異常高表達(dá)。但BRCA1參與了DNA損傷修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡等多個方面，BRCA1與VEGF在食管鱗癌中的協(xié)同作用具體與哪一個或哪些信號通路相關(guān)仍需要進一步研究。

綜上所述，BRCA1和VEGF可作為食管鱗癌診斷及預(yù)后評估的有效指標(biāo)，兩者均參與了食管癌發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜過程，隨著兩者分子生物學(xué)交互作用的進一步闡明，可能為評估食管癌生物學(xué)行為提供更多的標(biāo)志物。當(dāng)然，由于受到技術(shù)及研究設(shè)備的限制，本研究仍存在一些不足之處，主要是納入樣本量較小，隨機誤差影響較大，且未對食管癌患者治療手段進行詳細(xì)分類。故未來研究應(yīng)進一步納入更多的食管鱗癌患者并進行遠(yuǎn)期隨訪，同時對納入人群進行治療方法或年齡分層，以進一步證實BRCA1和VEGF在食管鱗癌篩查中的有效性和預(yù)后預(yù)測價值，探討兩者聯(lián)合評估對食管鱗癌的診斷及預(yù)后價值。