房 康, 郭項(xiàng)雨, 王宏偉, 熊行創(chuàng), 白 樺, 雷海民, 馬 強(qiáng)*(.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 0076;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 02488;.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院,北京 00029)

中藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分,是防治疾病的重要工具。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前全球有130多個(gè)國(guó)家和地區(qū)銷售中藥,世界上近四分之一的人口使用中藥。中藥制劑以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo),以中藥為原料,根據(jù)處方將其制成某種劑型供臨床直接使用,以達(dá)到最大限度地發(fā)揮藥物療效的目的。中藥活性成分是保證臨床療效的關(guān)鍵,其質(zhì)量控制尤為重要。建立中藥制劑指標(biāo)成分的分析檢測(cè)方法可為中藥制劑質(zhì)量控制提供保障,同時(shí)也是中藥現(xiàn)代化、國(guó)際化的關(guān)鍵[1]。目前色譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用于中藥制劑產(chǎn)品中丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等重要指標(biāo)成分和有效活性物質(zhì)的分離分析[2],已見(jiàn)報(bào)道的方法包括薄層色譜法[3]、氣相色譜法[4]、毛細(xì)管電泳法[5],高效/超高效液相色譜法[6]、生物色譜法[7]、超臨界流體色譜法[8]等。

離子遷移譜(ion mobility spectrometry,IMS)是一種利用大氣壓下電離形成的氣相離子在電場(chǎng)中遷移速率的差異對(duì)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行分離和表征的分析技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于毒品檢測(cè)[9]、公共安全[10,11]、食品及化妝品安全[12-16]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[17,18]、藥品檢測(cè)[19-23]、生命科學(xué)[24]等相關(guān)領(lǐng)域。離子遷移譜的基本原理是,待測(cè)樣品在電離反應(yīng)區(qū)進(jìn)行電離,產(chǎn)生的離子在電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)下,通過(guò)周期性開(kāi)啟的離子門進(jìn)入漂移區(qū),與逆向的中性漂移氣體分子不斷發(fā)生碰撞,使具有不同遷移率的離子得到分離并依次到達(dá)檢測(cè)電極[25,26]。在離子遷移譜測(cè)量中,首先要生成氣相離子,然后才能進(jìn)行產(chǎn)物離子的分離和檢測(cè)。離子遷移譜現(xiàn)有的離子化方式包括放射性離子化、電暈放電離子化、光致離子化、火焰離子化、電噴霧離子化等[27]。其中,電噴霧電離源的出現(xiàn),進(jìn)一步拓展了離子遷移譜的應(yīng)用范圍,可用于分析熱不穩(wěn)定和難揮發(fā)性化合物。特別是電噴霧電離-離子遷移譜技術(shù)已有用于中藥分析領(lǐng)域的研究報(bào)道[28-32]。

盡管離子遷移譜具有簡(jiǎn)單便攜、成本低廉、快速靈敏等優(yōu)點(diǎn),但分離能力有限,在樣品基質(zhì)較為復(fù)雜的情況下,可能存在無(wú)法滿足多組分同時(shí)分離需求、離子化過(guò)程中不同物質(zhì)間產(chǎn)生電離競(jìng)爭(zhēng)抑制等問(wèn)題。將離子遷移譜與液相色譜通過(guò)電噴霧接口聯(lián)用,離子遷移譜作為液相色譜的檢測(cè)器,彌補(bǔ)了液相色譜常用的紫外檢測(cè)器靈敏度低、對(duì)于分子結(jié)構(gòu)上缺少生色基團(tuán)的化合物沒(méi)有信號(hào)響應(yīng)的弊端。通過(guò)測(cè)量色譜分離柱流出物得到的離子遷移譜圖,從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)電噴霧電離前、基于疏水性差異和電噴霧電離后、基于離子遷移率不同的二維分離,可為復(fù)雜樣品體系的準(zhǔn)確鑒定提供更為豐富的化學(xué)信息,增強(qiáng)離子遷移譜的分析價(jià)值。液相色譜-離子遷移譜聯(lián)用技術(shù)目前已應(yīng)用于天然產(chǎn)物[33]、藥物小分子或中間體[34,35]、碳水化合物[36]、多肽[37]和蛋白質(zhì)[38]的分離分析。液相色譜-離子遷移譜聯(lián)用在硬件設(shè)備上較之液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,具有價(jià)格成本優(yōu)勢(shì),適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。同時(shí),離子遷移譜是在常壓下對(duì)氣態(tài)離子進(jìn)行分析而非質(zhì)譜儀所需的高真空條件,液相色譜與離子遷移譜聯(lián)用的接口裝置簡(jiǎn)單、易于搭建實(shí)現(xiàn)。

本文采用液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯(lián)用技術(shù),建立了中藥口服液中丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種代表性指標(biāo)成分的分析方法,并優(yōu)化了液相色譜、噴霧電壓、遷移管和氣體預(yù)加熱溫度、漂移氣流速等分析參數(shù),同時(shí)建立了指標(biāo)性成分的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜輔助確證方法,為中藥制劑質(zhì)量控制和活性成分檢測(cè)提供了科學(xué)有效的技術(shù)手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GA2100型便攜式離子遷移譜儀(美國(guó)Excellims公司),配有電噴霧離子源、離子?xùn)砰T控制器、空氣過(guò)濾裝置(含硫酸鈣和分子篩)、高分辨率離子遷移分析器、法拉第杯檢測(cè)器、VisIon儀器控制與數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),使用前用色氨酸和檸檬酸分別在正、負(fù)離子模式下校正儀器;QuickSplit 600-PO10-04型可調(diào)節(jié)式分流器(美國(guó)Analytical Scientific Instruments公司);ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQ-MS三重四極桿質(zhì)譜儀、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司);Milli-Q Integral 5型超純水器(美國(guó)Merck Millipore公司)。丹參素(CAS 22681-72-7,純度98%)和綠原酸(CAS 327-97-9,純度98%)購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司;甘草酸(CAS 1405-86-3,純度98%)、蘆丁(CAS 153-18-4,純度98%)、黃芩苷(CAS 21967-41-9,純度98%)和天麻素(CAS 62499-27-8,純度98%)購(gòu)自百靈威科技有限公司;葛根素(CAS 3681-99-0,純度98%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。7種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇配制成1 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,使用時(shí)根據(jù)需要用甲醇稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液;甲醇(色譜純)購(gòu)自美國(guó)Fisher公司;色氨酸和檸檬酸購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司,以甲醇配成10 mg/L校正液進(jìn)行儀器校正。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)室自行搭建的液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯(lián)用實(shí)驗(yàn)裝置示意圖如圖1所示。樣品溶液經(jīng)液相色譜分離后導(dǎo)入可調(diào)節(jié)式分流器(設(shè)置分流比為50∶1),流出液分為兩路:一路與離子遷移譜儀連接(1 μL/min),在噴霧電壓作用下發(fā)生電噴霧離子化,形成的離子進(jìn)入離子遷移譜的遷移管內(nèi)進(jìn)行分離,最終到達(dá)法拉第杯檢測(cè)器,檢測(cè)得到相應(yīng)測(cè)試圖譜;另一路流出液進(jìn)入三重四極桿質(zhì)譜儀,在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下采集7種待測(cè)物的信號(hào),可對(duì)離子遷移譜檢測(cè)結(jié)果作進(jìn)一步確證。

圖1 液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Schematic of the liquid chromatography-electrospray ionization-ion mobility spectrometry work flow

表1 7種待測(cè)物的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、離子化方式和遷移時(shí)間Table 1 Formulae,relative molecular masses (Mr), ionization modes and drift times of the seven analytes

1.3 液相色譜分離條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×1 mm,1.7 μm);流速:50 μL/min;流動(dòng)相A為0.5%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～3 min,5%B～10%B;3～10 min,10%B～80%B;10～12 min,80%B;12～12.1 min,80%B～5%B;12.1～15 min,5%B;柱溫:25 ℃;樣品室溫度:20 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.4 離子遷移譜分析條件

電噴霧電壓:2 400 V;離子化模式:負(fù)離子模式;遷移管電壓:8 000 V;遷移管溫度:190 ℃;氣體預(yù)加熱溫度:190 ℃;遷移譜寬:26 ms;Bradbury-Nielsen離子門脈沖寬度:110 μs，電壓:37 V;漂移氣流速:1.4 L/min;排氣泵抽速:1.0 L/min。7種待測(cè)物的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量和遷移時(shí)間見(jiàn)表1,離子遷移譜圖見(jiàn)圖2。

1.5 質(zhì)譜分析條件

電噴霧離子源負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓:2.8 kV;射頻透鏡電壓:0.3 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:800 L/h;錐孔氣流量:50 L/h;光電倍增器電壓:650 V;碰撞氣:氬氣;碰撞氣壓:0.32 Pa。7種待測(cè)物的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖3。

圖2 7種待測(cè)物的離子遷移譜圖Fig.2 Ion mobility spectra of the seven analytes

圖3 7種待測(cè)物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of the seven analytes

表2 7種待測(cè)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of the seven analytes

* Ions with higher responses.

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜分離條件的優(yōu)化

離子遷移譜在與液相色譜聯(lián)用時(shí),電噴霧電離源是最為常用的接口方式,通過(guò)高壓電場(chǎng)產(chǎn)生帶電液滴和待測(cè)物離子,而后進(jìn)入離子遷移譜檢測(cè)。由于本實(shí)驗(yàn)中離子遷移譜配備的電噴霧接口沒(méi)有內(nèi)置的輔助氣和加熱模塊,因此能夠耐受的流速范圍較低。綜合考慮適用流速、分離效率、色譜峰形以及與電噴霧接口兼容性等因素,本研究選用了微徑柱ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×1 mm,1.7 μm)。經(jīng)比較,以乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)溶劑可獲得較好的色譜性能和信號(hào)響應(yīng)。鑒于7種待測(cè)物均為酸性化合物,經(jīng)考察,以0.5%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相水相可獲得理想的色譜峰形和保留行為。

2.2 離子遷移譜噴霧電壓的優(yōu)化

噴霧電壓是決定目標(biāo)成分信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度及離子化效果的重要參數(shù)。樣品經(jīng)液相色譜分離,柱后流出液經(jīng)分流器分流后,在噴霧電壓作用下產(chǎn)生離子,進(jìn)入離子遷移譜,得到響應(yīng)信號(hào)。本實(shí)驗(yàn)考察噴霧電壓為1 600～2 600 V條件下,7種中藥指標(biāo)成分的響應(yīng)值。它們的最佳噴霧電壓略有差異,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。綜合考慮7種待測(cè)化合物各自的最佳噴霧電壓值及離子化效果,確定本方法的噴霧電壓為2 400 V。

2.3 離子遷移譜遷移管和氣體預(yù)加熱溫度的優(yōu)化

本研究考察了離子遷移譜遷移管和氣體預(yù)加熱溫度對(duì)目標(biāo)化合物信號(hào)強(qiáng)度的影響。為避免由于熱交換或其他因素而導(dǎo)致的離子遷移時(shí)間重現(xiàn)性差、響應(yīng)值不穩(wěn)定等問(wèn)題[39],實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化上述兩項(xiàng)參數(shù)時(shí)將其設(shè)為相同值。溫度過(guò)低時(shí),環(huán)境中水分子會(huì)對(duì)離子信號(hào)造成干擾;溫度過(guò)高會(huì)造成系統(tǒng)不穩(wěn)定,導(dǎo)致離子損失。分別考察了不同溫度(160、170、180、190、200 ℃)對(duì)7種中藥指標(biāo)成分響應(yīng)值的影響,結(jié)果如圖5所示。綜合考慮各目標(biāo)化合物離子的信號(hào)強(qiáng)度、信號(hào)漂移時(shí)間的穩(wěn)定性以及峰形,選擇190 ℃為遷移管和氣體預(yù)加熱溫度。

2.4 離子遷移譜漂移氣流速的優(yōu)化

漂移氣的種類和流速對(duì)離子分辨率和響應(yīng)強(qiáng)度存在一定的影響[40]?？諝鈶{借穩(wěn)定性強(qiáng)、成本低廉等優(yōu)勢(shì)被選用為漂移氣。本研究考察了不同漂移氣流速(1.2～2.2 L/min)對(duì)7種化合物分離效果和響應(yīng)強(qiáng)度的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。當(dāng)漂移氣流速過(guò)低時(shí),7種化合物的分辨率較差;而流速太高時(shí),響應(yīng)信號(hào)的強(qiáng)度降低,原因可能是目標(biāo)物被稀釋,電場(chǎng)力的作用被抵消,離子難以到達(dá)檢測(cè)器。經(jīng)考察,漂移氣的最佳流速為1.4 L/min。

圖4 不同噴霧電壓下7種待測(cè)物的信號(hào)響應(yīng)(n=3)Fig.4 Signal responses of the seven analytes at various spray voltages (n=3)

圖5 不同遷移管及氣體預(yù)加熱溫度下7種待測(cè)物的信號(hào)響應(yīng)(n=3)Fig.5 Signal responses of the seven analytes at various drift tube and gas pre-heating temperatures (n=3)

圖6 不同漂移氣流速下7種待測(cè)物的信號(hào)響應(yīng)(n=3)Fig.6 Signal responses of the seven analytes at various drift gas velocities (n=3)

2.5 液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯(lián)用分析

在分別對(duì)液相色譜和離子遷移譜條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上,將液相色譜通過(guò)電噴霧離子源與離子遷移譜聯(lián)用,進(jìn)行二維分離分析,結(jié)果見(jiàn)圖7。丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁可同時(shí)實(shí)現(xiàn)電噴霧電離前、基于疏水性差異和電噴霧電離后、基于離子遷移率不同的二維分離,因此每種成分分別具有各自的色譜保留時(shí)間和離子遷移譜遷移時(shí)間,用于識(shí)別確認(rèn)。丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種中藥指標(biāo)性成分的檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3 7種待測(cè)物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r),limits of detection (LODs)and limits of quantitation (LOQs)of the seven analytes

y:peak area;x:mass concentration,μg/mL.

由于常規(guī)液相色譜柱的工作流速通常在mL/min數(shù)量級(jí),而電噴霧離子遷移譜能夠耐受的流速范圍較低,通常在μL/min級(jí)別,二者之間并不匹配。離子遷移譜配備的電噴霧離子源沒(méi)有專門的脫溶劑氣和加熱模塊,過(guò)高的進(jìn)樣流速會(huì)造成離子化效率降低,離子遷移譜信號(hào)噪聲增加。利用色譜柱后分流技術(shù)可以得到較低流速,以適應(yīng)電噴霧離子遷移譜的兼容要求。為了盡可能降低設(shè)置分流比所導(dǎo)致的樣品流失,本研究采用了內(nèi)徑為1 mm的微徑色譜柱,其適宜的工作流速約為50 μL/min。但推測(cè)由于在色譜柱后分流過(guò)程中,經(jīng)過(guò)分流器流向離子遷移譜的溶液流速由分流器前的50 μL/min降低至約1 μL/min,流速的驟降導(dǎo)致管路內(nèi)壓力的大幅降低,進(jìn)而導(dǎo)致管路內(nèi)成分譜帶在一定程度上發(fā)生擴(kuò)散、峰形擴(kuò)展,且各譜帶有同步趨同的趨勢(shì)。而經(jīng)過(guò)分流器流向質(zhì)譜的溶液流速為49 μL/min,較之分流器前的流速幾乎維持不變,也幾乎不會(huì)造成壓力的波動(dòng),因此譜帶分布總體上延續(xù)原有狀態(tài)。

2.6 液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜分析確證

本研究還開(kāi)發(fā)了丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種指標(biāo)性成分的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜確證方法。每種目標(biāo)化合物分別選擇一個(gè)前體離子和對(duì)應(yīng)的兩個(gè)產(chǎn)物離子作為監(jiān)測(cè)離子對(duì),7種待測(cè)成分的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2。如果樣品中目標(biāo)化合物的離子相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致,且偏差不超過(guò)表2中對(duì)應(yīng)的允許偏差,則判斷樣品中含有相應(yīng)的目標(biāo)化合物。

2.7 樣品測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)兒感退熱寧口服液、清開(kāi)靈口服液、小兒清肺化痰口服液、小兒七星茶口服液、雙黃連口服液等5件中藥口服液實(shí)際樣品進(jìn)行了檢測(cè)分析。經(jīng)測(cè)定,上述中藥口服液樣品中,指標(biāo)性成分甘草酸的含量為730.69和841.82 μg/mL,黃芩苷的含量分別為4.22、6.51和13.08 mg/mL,均達(dá)到了《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中的含量要求。

3 結(jié)論

本研究采用液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯(lián)用技術(shù),利用離子遷移譜高分辨、快速分離以及與液相色譜分離之間具有正交性的特點(diǎn),建立了中藥口服液中丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種指標(biāo)性成分的分離分析方法。液相色譜和離子遷移譜分別基于目標(biāo)化合物的疏水性和離子遷移率差異進(jìn)行分離,由此組成的二維分離體系在分離能力上可相互補(bǔ)充,提高樣品分離分析效率,可為復(fù)雜樣品體系的全面解析提供更為豐富的綜合信息。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中,將探索采用微升/納升液相色譜與離子遷移譜聯(lián)用的相關(guān)研究。