徐敦明, 賴國銀*, 陳 燕, 羅 超, 伊雄海, 鄧曉軍, 馮 峰, 張 峰(.廈門海關(guān)技術(shù)中心,福建 廈門 606;.上海海關(guān)動植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心,上海 005;.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所,北京 00)

近年來,隨著人民生活水平的提高和保健食品加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,人們對保健食品的需求量越來越大。由國家食藥監(jiān)總局及地方食藥監(jiān)局2016～2017年食品抽檢公告可知,盡管保健食品總體合格率很高,達(dá)98.3%,但仍有40余例保健食品非法添加案例,主要集中在減肥、輔助降血糖、免疫調(diào)節(jié)類產(chǎn)品,其中絕大多數(shù)為假冒產(chǎn)品。一些不法廠商為達(dá)到產(chǎn)品宣稱的功效,在保健食品中直接添加化學(xué)藥物,消費(fèi)者若長期食用該類保健食品,身體將產(chǎn)生不良反應(yīng)。

原國家食品藥品監(jiān)督管理總局已發(fā)布了對減肥類、降脂類、降壓類、降糖類保健食品中違法添加化學(xué)藥物的補(bǔ)充檢測方法,編號分別為2006004、2009029、2011008、2012005、201300及食藥監(jiān)辦許(2010)114號,大部分的檢測方法采用薄層色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，樣品前處理為超聲提取后直接上機(jī)測定。然而保健食品中成分較多,基質(zhì)復(fù)雜,基質(zhì)效應(yīng)(ME)強(qiáng)且對儀器的抗污染能力要求較高。目前用于減肥類、降脂類、降糖類、降壓類保健食品中非法添加藥物的檢測方法主要有液相色譜法[1-4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-21]、超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法[22]、拉曼光譜法[23]、薄層色譜法[24]等。其中,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)在保健食品中非法添加藥物的定性及定量分析中得到了廣泛的應(yīng)用。保健品有口服液、片劑、硬膠囊和軟膠囊等不同劑型,特別是膠囊劑型,由于制劑輔料的加入,使樣品基質(zhì)更加復(fù)雜,影響了方法的靈敏度和抗干擾性[21]。因此,選擇合適的前處理凈化方法顯得尤為重要。

針對4種不同劑型,本文重點(diǎn)對提取溶劑、凈化柱及洗脫溶劑進(jìn)行了研究論證。為打擊不同功效保健食品中交叉添加化學(xué)藥物的行為,減少樣品在測定過程中對儀器帶來的污染,降低基質(zhì)干擾對測定的干擾,本文通過優(yōu)化凈化過程,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,可以同時(shí)篩查測定減肥類、降脂類、降糖類、降壓類保健食品中21種非法添加藥物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國Waters公司;P 300H超聲波清洗器(超聲功率380 W),德國Elma公司;分析天平,瑞士梅特勒公司;渦旋混合器,德國IKA公司;氮吹儀,美國Organomation公司。

甲醇、乙腈,色譜純,德國Merck公司;乙酸銨,色譜純,美國Sigma公司。

標(biāo)準(zhǔn)品:麻黃堿(ephedrine)、芬氟拉明(fenfluramine)、N,N-雙去甲基西布曲明(N,N-didesmiehylsibutramine)、N-單去甲基西布曲明(N-monodesmiehylsibutramine)、西布曲明(sibutramine)、苯乙雙胍(phenformin)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、格列齊特(gliclazide)、吡咯列酮(pioglitazone)、格列波脲(glibornuride)、格列吡嗪(glipizide)、瑞格列奈(repaglinide)、格列美脲(glimepiride)、格列本脲(glibenclamide)、格列喹酮(gliquidone)、可樂定(clonidine)、利血平(reserpine)、去羥基洛伐他汀(dehydro lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)均購于中國食品藥品檢定研究院?；旌闲完庪x子(PAX)固相萃取柱(60 mg/3 mL),美國Agilent公司;親水親脂型(HLB)固相萃取柱(60 mg/3 mL),美國Waters公司。

1.2 樣品前處理

顆粒、片劑樣品:取適量,研細(xì);膠囊樣品:取內(nèi)容物;液體樣品:取1 g,加入1 mL飽和氯化鈉溶液。

稱取0.5 g(精確至0.000 1 g)處理過的供試樣品,置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻后超聲提取15 min,以5 000 r/min離心10 min,移取乙腈層至另一離心管中;殘?jiān)儆?0 mL乙腈超聲提取15 min,以5 000 r/min離心10 min;合并乙腈層,氮吹約至0.5 mL后,加入10 mL水渦旋,待凈化。

將HLB固相萃取柱接于固相萃取裝置上,依次用5 mL甲醇、5 mL水活化小柱,用5 mL 5%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇水平衡后,將待凈化的樣品溶液加入小柱內(nèi),控制流速1滴/s,待樣品溶液流盡后,用4 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱,最后用5 mL 90%甲醇水溶液洗脫小柱,收集洗脫液至5 mL容量瓶中,定容至刻度,經(jīng)0.22 μm混合型濾膜過濾后作為測定液。

1.3 分析條件

色譜柱為Waters BEH C18柱 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫為30 ℃;流動相:A為10 mmol/L乙酸銨水溶液,B為甲醇;流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min,70%A;2.0～4.0 min,70%A～40%A;4.0～8.0 min,40%A～30%A;8.0～10.5 min,30%A～70%A;10.5～14.0 min,70%A。進(jìn)樣量為2 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源;掃描方式為正離子掃描;檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;去溶劑氣流量為900 L/H;去溶劑氣溫度為650 ℃。

21種目標(biāo)化合物的保留時(shí)間、母離子、子離子、錐孔電壓(CV)、碰撞電壓(CE)等其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 21種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 21 target compounds

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水作為流動相體系時(shí)的分離效果,發(fā)現(xiàn)用甲醇-水時(shí),降脂類等化合物的響應(yīng)明顯增強(qiáng),且各化合物之間分離效果較好。此外,在水中加入10 mmol/L乙酸銨后明顯能改善化合物的峰形。因此最終選用10 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇作為流動相體系,此時(shí)21種目標(biāo)化合物分析時(shí)間較短,分離效果好,響應(yīng)高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣方式對21種目標(biāo)化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜分析,得到各自的母離子。對目標(biāo)化合物進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描,得到物質(zhì)的子離子信息,確定目標(biāo)化合的定量、定性離子對。通過優(yōu)化各物質(zhì)的錐孔電壓、碰撞能量,確定各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)(見表1)。圖1為代表性藥物麻黃堿、芬氟拉明、吡咯列酮和美伐他汀(100 μg/L)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖。

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)對比了甲醇、乙腈兩種提取溶劑對提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種溶劑對目標(biāo)化合物的提取效率無顯著性差異,考慮到口服液樣品中存在水,而甲醇與水混合后不能有效分層,故最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3.2超聲時(shí)間的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對比了不同超聲時(shí)間(10、15、20、25和30 min)對提取效率的影響。結(jié)果顯示,超聲時(shí)間對提取效率無顯著性差異,從節(jié)約、環(huán)保的角度考慮,結(jié)合目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的對各化合物補(bǔ)充檢驗(yàn)方法中的提取時(shí)間,本實(shí)驗(yàn)確定15 min為樣品超聲時(shí)間。

圖1 麻黃堿、芬氟拉明、吡咯列酮和美伐他汀(100 μg/L)的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.1 Chromatograms of ephedrine,fenfluramine, pioglitazone and mevastatin (100 μg/L)in multiple reaction monitoring (MRM)mode

2.3.3凈化方法的優(yōu)化

針對21種目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)式中存在的多種官能團(tuán),如季銨離子、苯環(huán),實(shí)驗(yàn)考察了QuEChERS(900 mg Mg2SO4、150 mgN-丙基乙二胺(PSA)、15 mg石墨化炭黑(GCB))、PAX固相萃取柱、HLB固相萃取柱對樣品的凈化效果。結(jié)果顯示,采用QuEChERS及PAX固相萃取柱時(shí),某些目標(biāo)化合物的回收率不夠理想,而采用HLB固相萃取柱時(shí),目標(biāo)化合物的回收率均較好。故實(shí)驗(yàn)選用HLB固相萃取柱作為凈化小柱。

以HLB固相萃取柱作為凈化小柱,本實(shí)驗(yàn)考察了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇水溶液作為洗脫液時(shí)的洗脫效果。將21種目標(biāo)化合物的水溶液上樣,然后分別用體積分?jǐn)?shù)為0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇水溶液洗脫,收集洗脫液上機(jī)測定,考察各目標(biāo)化合物的洗脫效果(見圖2)。實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)在70%以下時(shí)，僅有麻黃堿、芬氟拉明、可樂定和利血平被洗脫下來;當(dāng)以90%甲醇水溶液為洗脫溶劑時(shí),目標(biāo)化合物的整體回收率最好,大部分物質(zhì)的回收率>80%。因此實(shí)驗(yàn)選擇90%甲醇水溶液作為洗脫溶液。

圖2 甲醇的體積分?jǐn)?shù)對21種化合物(100 μg/L)回收率的影響Fig.2 Effect of volume of percentage of methanol on the recoveries of the 21 compounds (100 μg/L)

2.4 方法學(xué)評價(jià)

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)

與其他分析手段不同的是,質(zhì)譜分析尤其是以電噴霧電離源為離子源的質(zhì)譜分析可能會存在基質(zhì)效應(yīng)。保健食品多采用天然材料,基質(zhì)中的雜質(zhì)會對目標(biāo)化合物的分析產(chǎn)生一定的干擾,影響分析的準(zhǔn)確度、靈敏度和精密度。本實(shí)驗(yàn)選取了口服液、片劑、硬膠囊和軟膠囊4種具有代表性的空白基質(zhì)溶液,與定容溶劑分別配制相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用公式ME=(基質(zhì)匹配曲線的斜率/標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)為負(fù)值時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng);基質(zhì)效應(yīng)為正值時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明,大部分化合物在這幾種基質(zhì)中都有不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)(見表S1,詳見http://www.chrom-China.com,下同)。特別是吡格列酮和去羥基洛伐他汀的基質(zhì)抑制效應(yīng)較大,均大于20%。為了消除基質(zhì)效應(yīng)帶來的影響,本文采用基質(zhì)匹配曲線進(jìn)行線性觀察和含量測定。

2.4.2方法的線性范圍、檢出限和定量限

為考察樣品基質(zhì)的影響,實(shí)驗(yàn)分別使用甲醇和口服液、片劑、硬膠囊、軟膠囊空白基質(zhì)溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以色譜峰的峰面積對待測成分的質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,在考察的范圍內(nèi),各種基質(zhì)中21種非法添加化合物均呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均≥0.995(見表S1)。

通過向4種劑型的陰性樣品中添加21種待測成分,考察方法的檢出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10),不同基質(zhì)的檢出限為3～160 μg/kg,定量限為10～500 μg/kg(見表2)。

表2 21種目標(biāo)化合物的線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs)of the 21 target compounds

表2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.4.3回收率和精密度

按照1.2節(jié)的前處理方法,向空白基質(zhì)中分別加入低、中、高(100、500和1 000 μg/kg)3個(gè)水平的加標(biāo)量，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn),結(jié)果見表3。4種劑型中21種化合物的平均回收率為61.8%～109.3%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～14.7%。方法的加標(biāo)回收率和精密度都均符合殘留檢測的要求。

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用本文方法對市售常見的保健食品進(jìn)行檢測,其中口服液、片劑、硬膠囊和軟膠囊各5份,涵蓋減肥類、降脂類、降糖類和降壓類。結(jié)果表明,在一個(gè)口服液產(chǎn)品中檢出苯乙雙胍(1.2 mg/kg);在一個(gè)片劑中檢出西布曲明(10.6 mg/kg)和格列美脲(504.3 mg/kg)。

表3 4種劑型中21種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs)of the 21 target compounds in the four dosage forms (n=6)

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

Recoveries and RSDs from left to right represented the results of three spiked levels of 100,500,and 1000 μg/kg.

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定減肥類、降脂類、降壓類、降糖類保健食品中21種非法添加藥物的方法。該方法能夠滿足同時(shí)檢測多類保健食品中非法添加藥物的要求,可以為保健食品非法添加的檢測工作提供有力的技術(shù)支持。