徐敦明, 賴國銀*, 陳 燕, 羅 超, 伊雄海, 鄧曉軍, 馮 峰, 張 峰(.廈門海關技術中心,福建 廈門 606;.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 005;.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所,北京 00)

近年來,隨著人民生活水平的提高和保健食品加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,人們對保健食品的需求量越來越大。由國家食藥監(jiān)總局及地方食藥監(jiān)局2016～2017年食品抽檢公告可知,盡管保健食品總體合格率很高,達98.3%,但仍有40余例保健食品非法添加案例,主要集中在減肥、輔助降血糖、免疫調節(jié)類產(chǎn)品,其中絕大多數(shù)為假冒產(chǎn)品。一些不法廠商為達到產(chǎn)品宣稱的功效,在保健食品中直接添加化學藥物,消費者若長期食用該類保健食品,身體將產(chǎn)生不良反應。

原國家食品藥品監(jiān)督管理總局已發(fā)布了對減肥類、降脂類、降壓類、降糖類保健食品中違法添加化學藥物的補充檢測方法,編號分別為2006004、2009029、2011008、2012005、201300及食藥監(jiān)辦許(2010)114號,大部分的檢測方法采用薄層色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法，樣品前處理為超聲提取后直接上機測定。然而保健食品中成分較多,基質復雜,基質效應(ME)強且對儀器的抗污染能力要求較高。目前用于減肥類、降脂類、降糖類、降壓類保健食品中非法添加藥物的檢測方法主要有液相色譜法[1-4]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[5-21]、超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜法[22]、拉曼光譜法[23]、薄層色譜法[24]等。其中,液相色譜-串聯(lián)質譜法因具有高選擇性、高靈敏度的優(yōu)點在保健食品中非法添加藥物的定性及定量分析中得到了廣泛的應用。保健品有口服液、片劑、硬膠囊和軟膠囊等不同劑型,特別是膠囊劑型,由于制劑輔料的加入,使樣品基質更加復雜,影響了方法的靈敏度和抗干擾性[21]。因此,選擇合適的前處理凈化方法顯得尤為重要。

針對4種不同劑型,本文重點對提取溶劑、凈化柱及洗脫溶劑進行了研究論證。為打擊不同功效保健食品中交叉添加化學藥物的行為,減少樣品在測定過程中對儀器帶來的污染,降低基質干擾對測定的干擾,本文通過優(yōu)化凈化過程,建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法,可以同時篩查測定減肥類、降脂類、降糖類、降壓類保健食品中21種非法添加藥物。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀,美國Waters公司;P 300H超聲波清洗器(超聲功率380 W),德國Elma公司;分析天平,瑞士梅特勒公司;渦旋混合器,德國IKA公司;氮吹儀,美國Organomation公司。

甲醇、乙腈,色譜純,德國Merck公司;乙酸銨,色譜純,美國Sigma公司。

標準品:麻黃堿(ephedrine)、芬氟拉明(fenfluramine)、N,N-雙去甲基西布曲明(N,N-didesmiehylsibutramine)、N-單去甲基西布曲明(N-monodesmiehylsibutramine)、西布曲明(sibutramine)、苯乙雙胍(phenformin)、甲苯磺丁脲(tolbutamide)、格列齊特(gliclazide)、吡咯列酮(pioglitazone)、格列波脲(glibornuride)、格列吡嗪(glipizide)、瑞格列奈(repaglinide)、格列美脲(glimepiride)、格列本脲(glibenclamide)、格列喹酮(gliquidone)、可樂定(clonidine)、利血平(reserpine)、去羥基洛伐他汀(dehydro lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)均購于中國食品藥品檢定研究院?；旌闲完庪x子(PAX)固相萃取柱(60 mg/3 mL),美國Agilent公司;親水親脂型(HLB)固相萃取柱(60 mg/3 mL),美國Waters公司。

1.2 樣品前處理

顆粒、片劑樣品:取適量,研細;膠囊樣品:取內(nèi)容物;液體樣品:取1 g,加入1 mL飽和氯化鈉溶液。

稱取0.5 g(精確至0.000 1 g)處理過的供試樣品,置于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋混勻后超聲提取15 min,以5 000 r/min離心10 min,移取乙腈層至另一離心管中;殘渣再用10 mL乙腈超聲提取15 min,以5 000 r/min離心10 min;合并乙腈層,氮吹約至0.5 mL后,加入10 mL水渦旋,待凈化。

將HLB固相萃取柱接于固相萃取裝置上,依次用5 mL甲醇、5 mL水活化小柱,用5 mL 5%(體積分數(shù),下同)甲醇水平衡后,將待凈化的樣品溶液加入小柱內(nèi),控制流速1滴/s,待樣品溶液流盡后,用4 mL 5%甲醇水溶液淋洗小柱,最后用5 mL 90%甲醇水溶液洗脫小柱,收集洗脫液至5 mL容量瓶中,定容至刻度,經(jīng)0.22 μm混合型濾膜過濾后作為測定液。

1.3 分析條件

色譜柱為Waters BEH C18柱 (100 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫為30 ℃;流動相:A為10 mmol/L乙酸銨水溶液,B為甲醇;流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min,70%A;2.0～4.0 min,70%A～40%A;4.0～8.0 min,40%A～30%A;8.0～10.5 min,30%A～70%A;10.5～14.0 min,70%A。進樣量為2 μL。

離子源為電噴霧電離(ESI)源;掃描方式為正離子掃描;檢測模式為多反應監(jiān)測(MRM)模式;去溶劑氣流量為900 L/H;去溶劑氣溫度為650 ℃。

21種目標化合物的保留時間、母離子、子離子、錐孔電壓(CV)、碰撞電壓(CE)等其他質譜參數(shù)見表1。

表1 21種目標化合物的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 21 target compounds

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

* Quantitative ion.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實驗分別考察了甲醇-水、乙腈-水作為流動相體系時的分離效果,發(fā)現(xiàn)用甲醇-水時,降脂類等化合物的響應明顯增強,且各化合物之間分離效果較好。此外,在水中加入10 mmol/L乙酸銨后明顯能改善化合物的峰形。因此最終選用10 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇作為流動相體系,此時21種目標化合物分析時間較短,分離效果好,響應高。

2.2 質譜條件的優(yōu)化

采用直接進樣方式對21種目標化合物進行一級質譜分析,得到各自的母離子。對目標化合物進行二級質譜掃描,得到物質的子離子信息,確定目標化合的定量、定性離子對。通過優(yōu)化各物質的錐孔電壓、碰撞能量,確定各目標化合物的質譜參數(shù)(見表1)。圖1為代表性藥物麻黃堿、芬氟拉明、吡咯列酮和美伐他汀(100 μg/L)的多反應監(jiān)測色譜圖。

2.3 提取方法的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的優(yōu)化

實驗對比了甲醇、乙腈兩種提取溶劑對提取效率的影響。結果發(fā)現(xiàn),兩種溶劑對目標化合物的提取效率無顯著性差異,考慮到口服液樣品中存在水,而甲醇與水混合后不能有效分層,故最終選擇乙腈作為提取溶劑。

2.3.2超聲時間的優(yōu)化

本實驗對比了不同超聲時間(10、15、20、25和30 min)對提取效率的影響。結果顯示,超聲時間對提取效率無顯著性差異,從節(jié)約、環(huán)保的角度考慮,結合目前國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的對各化合物補充檢驗方法中的提取時間,本實驗確定15 min為樣品超聲時間。

圖1 麻黃堿、芬氟拉明、吡咯列酮和美伐他汀(100 μg/L)的多反應監(jiān)測色譜圖Fig.1 Chromatograms of ephedrine,fenfluramine, pioglitazone and mevastatin (100 μg/L)in multiple reaction monitoring (MRM)mode

2.3.3凈化方法的優(yōu)化

針對21種目標化合物結構式中存在的多種官能團,如季銨離子、苯環(huán),實驗考察了QuEChERS(900 mg Mg2SO4、150 mgN-丙基乙二胺(PSA)、15 mg石墨化炭黑(GCB))、PAX固相萃取柱、HLB固相萃取柱對樣品的凈化效果。結果顯示,采用QuEChERS及PAX固相萃取柱時,某些目標化合物的回收率不夠理想,而采用HLB固相萃取柱時,目標化合物的回收率均較好。故實驗選用HLB固相萃取柱作為凈化小柱。

以HLB固相萃取柱作為凈化小柱,本實驗考察了不同體積分數(shù)的甲醇水溶液作為洗脫液時的洗脫效果。將21種目標化合物的水溶液上樣,然后分別用體積分數(shù)為0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇水溶液洗脫,收集洗脫液上機測定,考察各目標化合物的洗脫效果(見圖2)。實驗表明,當甲醇體積分數(shù)在70%以下時，僅有麻黃堿、芬氟拉明、可樂定和利血平被洗脫下來;當以90%甲醇水溶液為洗脫溶劑時,目標化合物的整體回收率最好,大部分物質的回收率>80%。因此實驗選擇90%甲醇水溶液作為洗脫溶液。

圖2 甲醇的體積分數(shù)對21種化合物(100 μg/L)回收率的影響Fig.2 Effect of volume of percentage of methanol on the recoveries of the 21 compounds (100 μg/L)

2.4 方法學評價

2.4.1基質效應

與其他分析手段不同的是,質譜分析尤其是以電噴霧電離源為離子源的質譜分析可能會存在基質效應。保健食品多采用天然材料,基質中的雜質會對目標化合物的分析產(chǎn)生一定的干擾,影響分析的準確度、靈敏度和精密度。本實驗選取了口服液、片劑、硬膠囊和軟膠囊4種具有代表性的空白基質溶液,與定容溶劑分別配制相同濃度的標準溶液。采用公式ME=(基質匹配曲線的斜率/標準曲線的斜率-1)×100%計算基質效應?；|效應為負值時表示存在基質抑制效應;基質效應為正值時表示存在基質增強效應。結果表明,大部分化合物在這幾種基質中都有不同程度的基質抑制效應(見表S1,詳見http://www.chrom-China.com,下同)。特別是吡格列酮和去羥基洛伐他汀的基質抑制效應較大,均大于20%。為了消除基質效應帶來的影響,本文采用基質匹配曲線進行線性觀察和含量測定。

2.4.2方法的線性范圍、檢出限和定量限

為考察樣品基質的影響,實驗分別使用甲醇和口服液、片劑、硬膠囊、軟膠囊空白基質溶液配制系列標準溶液,以色譜峰的峰面積對待測成分的質量濃度繪制標準曲線。結果表明,在考察的范圍內(nèi),各種基質中21種非法添加化合物均呈良好的線性關系,相關系數(shù)均≥0.995(見表S1)。

通過向4種劑型的陰性樣品中添加21種待測成分,考察方法的檢出限(S/N≥3)和定量限(S/N≥10),不同基質的檢出限為3～160 μg/kg,定量限為10～500 μg/kg(見表2)。

表2 21種目標化合物的線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,limits of detection (LODs)and limits of quantification (LOQs)of the 21 target compounds

表2 (續(xù))Table 2 (Continued)

2.4.3回收率和精密度

按照1.2節(jié)的前處理方法,向空白基質中分別加入低、中、高(100、500和1 000 μg/kg)3個水平的加標量，進行加標回收率和精密度試驗,結果見表3。4種劑型中21種化合物的平均回收率為61.8%～109.3%,相對標準偏差為1.6%～14.7%。方法的加標回收率和精密度都均符合殘留檢測的要求。

2.5 實際樣品檢測

采用本文方法對市售常見的保健食品進行檢測,其中口服液、片劑、硬膠囊和軟膠囊各5份,涵蓋減肥類、降脂類、降糖類和降壓類。結果表明,在一個口服液產(chǎn)品中檢出苯乙雙胍(1.2 mg/kg);在一個片劑中檢出西布曲明(10.6 mg/kg)和格列美脲(504.3 mg/kg)。

表3 4種劑型中21種目標化合物的加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs)of the 21 target compounds in the four dosage forms (n=6)

表3 (續(xù))Table 3 (Continued)

Recoveries and RSDs from left to right represented the results of three spiked levels of 100,500,and 1000 μg/kg.

3 結論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時測定減肥類、降脂類、降壓類、降糖類保健食品中21種非法添加藥物的方法。該方法能夠滿足同時檢測多類保健食品中非法添加藥物的要求,可以為保健食品非法添加的檢測工作提供有力的技術支持。