孟 佳, 古淑青, 方 真, 鈕 冰, 鄧曉軍, 郭德華, 朱 堅, 韓 芳(.上海大學生命科學學院食品工程系,上海 00444;.上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 005;.安徽出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心,安徽 合肥 00)

近年來,食物過敏已經(jīng)成為一個全球性的健康問題,由于飲食多樣性及食物的復雜性,食物過敏患病率逐年上升。西方國家最近的研究表明,成人患病率在5%左右,兒童患病率在8%左右[1-4]。典型的過敏癥狀包括引發(fā)蕁麻疹、嘔吐、哮喘、腹瀉等,嚴重者可引起過敏性休克甚至危及生命[5]。食物過敏目前沒有有效的治療方案,在商品標簽上進行明確的標注提示消費者規(guī)避是唯一的選擇。然而,由于目前各個國家和地區(qū)對食品過敏原的研究和關注水平存在較大差距,過敏原標識管理不統(tǒng)一,產(chǎn)品中過敏原應標未標的情況普遍存在[6]。并且,即便標簽上對已知過敏原進行了標注,在產(chǎn)品加工、運輸和存儲過程中存在不可避免的交叉污染,有可能帶來一些隱形的未知過敏原[7]。因此,有必要開發(fā)出一套適用于復雜食品基質(zhì)的準確快速的過敏原檢測方法。

水產(chǎn)品作為人類食物的重要來源之一,其市場和消費群體不斷擴大。與此同時,由水產(chǎn)品引發(fā)的食物過敏也日益增多,在聯(lián)合國糧農(nóng)組織公布的8大類過敏食物中,水產(chǎn)品就占了兩大類,并且水產(chǎn)品是導致過敏最嚴重的食物之一。目前,常用的水產(chǎn)品過敏原分析方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和聚合酶鏈反應(PCR)法。ELISA方法操作簡便且有商品化試劑盒,但是該方法受產(chǎn)品加工方式影響較大,熱加工食品由于化學或物理方法導致的蛋白質(zhì)免疫化學識別受損,會降低過敏原的檢測濃度[8,9],造成假陰性。并且大多數(shù)試劑盒只能檢測單一過敏原,通量低且易發(fā)生交叉反應[10]。PCR方法能夠通過特定的DNA對水產(chǎn)品過敏原進行定性和定量檢測,但是檢測物是DNA而非致敏蛋白質(zhì)[11-13]?；诘鞍踪|(zhì)組學的質(zhì)譜檢測方法既克服了免疫學方法存在的通量低和交叉干擾的弊端,也克服了PCR技術不能直接檢測致敏蛋白質(zhì)的缺點,能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)和多肽進行明確鑒定,并且可以同時實現(xiàn)多種過敏原的定性和定量檢測[14]。目前已有多種質(zhì)譜方法用于水產(chǎn)品過敏原的檢測,包括利用四極桿-飛行時間質(zhì)譜(Q/TOF)檢測草蝦中的過敏原精氨酸激酶蛋白[15],利用三重四極桿質(zhì)譜(QqQ)檢測雪蟹中的過敏原原肌球蛋白[16],利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)檢測蝦中的過敏原精氨酸激酶[17]和多種魚類中的過敏原小清蛋白[18],利用液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜(LC-ESI-IT-MS/MS)確定完整魚類過敏原小清蛋白[19]等。但同時確定大閘蟹、青蟹、南美白蝦、金槍魚和大西洋鮭魚5種水產(chǎn)品的生物標志性特征肽段,并對過敏原蛋白進行定量研究還未見報道。

本研究針對復雜的食品基質(zhì),采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q/Exactive-HRMS)和超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-QqQ-MS)相結(jié)合,篩選出大閘蟹、青蟹、南美白蝦、金槍魚和大西洋鮭魚的主要過敏原蛋白原肌球蛋白、肌球蛋白、血藍蛋白和小清蛋白的30個特征性多肽,建立了基于特征肽段的水產(chǎn)品過敏原定量檢測方法。該方法重現(xiàn)性好、通量高,可用于肉制品及調(diào)味料中多種水產(chǎn)品過敏原的快速篩查和定量檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜(Dionex UltiMate 3000)-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(Q-Exactive,Thermo Fisher,美國);液相色譜(Nexera X2)-三重四極桿質(zhì)譜(triple quadrupole system,TQS)聯(lián)用儀(MS8060,Shimadzu,日本);水浴鍋(SW22,Julabo,德國);離心機(Allegra X-22R,Beckman Coulter,美國);高速振蕩機(Eyela,日本);氮吹儀(Jnc,美國)。所有實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore,美國)制得。

碳酸氫銨(純度≥99%)、二硫蘇糖醇(DTT、純度≥99%)、碘代乙酰胺(IAA,純度≥99%)、氯化鈣(純度≥99%)(Sigma,美國);三氟乙酸(TFA,純度≥98%)和甲酸(98%,色譜純)(Fluka,美國);牛胰蛋白酶(測序級,Promega公司,美國);乙腈(色譜純,純度≥99%,Thermo Fisher,美國);三氯甲烷(純度≥99%,TEDIA,美國);Tris-HCl緩沖液(1 mol/L)、Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司);正己烷(色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司);丙酮(色譜純,CNW,德國);超濾離心管(1.5 mL,Anpel,中國);低蛋白吸附離心管(1.5 mL,Eppendorf,德國);低蛋白吸附移液器吸頭(0.1 mL/1.0 mL,Brand,德國);低蛋白吸附濾膜(0.22 μm,Agela,美國)。南美白蝦、大西洋鮭魚、青蟹、大閘蟹和金槍魚樣品均為市售。

1.2 樣品前處理

1.2.1蛋白質(zhì)提取

取2 g均質(zhì)化的樣品置于50 mL離心管中,加入0.1%(體積分數(shù),下同)的三氟乙酸(TFA)/氯仿(1∶4,v/v)進行氯仿脫脂,渦旋震蕩5 min,以4 500 r/min的速度離心3 min,去除上清液,以上步驟重復兩次后,氮氣吹干。加入10 mL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0±0.2)進行提取,渦旋震蕩1 min,在60 ℃水浴鍋中震蕩1 h后,以4 500 r/min的速度離心5 min,過膜。得到質(zhì)量濃度為2.0×105mg/L的蛋白質(zhì)提取儲備液。于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2蛋白質(zhì)酶解

蛋白質(zhì)酶解步驟與文獻[20]報道相似。取200 μL上清液,置于1.5 mL的低蛋白離心管中,加入150 μL 500 mmol/L碳酸氫銨溶液和10 μL 500 mmol/L DTT,混勻后置于75 ℃水浴鍋恒溫震蕩30 min,取出至室溫后加入30 μL 500 mmol/L IAA,放于暗處30 min后,加入10 μL 100 mmol/L氯化鈣和50 μL 500 mg/L牛胰蛋白酶溶液,混勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋中,過夜酶解12 h,加入10 μL甲酸終止酶解,靜置15 min后,加水定容至1 mL,過低蛋白吸附膜,質(zhì)譜檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1UPLC-Q/Orbitrap-HRMS條件

色譜條件:采用Kinetex XB-C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm,Phenomenex,美國)。進樣體積:5 μL;柱溫:35 ℃。流動相A為0.1%甲酸-水溶液,流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。采用梯度洗脫:0～3 min,97%A;3～10 min,97%A～70%A;10～13 min,70%A～20%A;13～16 min,20%A;16～20 min,97%A。流速:0.2 mL/min。

質(zhì)譜條件:電噴霧電離(ESI)源,采用正離子模式;保護氣壓力:206.85 kPa;輔助氣壓力:68.95 kPa;噴嘴電壓:3.5 kPa;毛細管溫度:320 ℃;輔助氣溫度:250 ℃;全掃描模式;掃描范圍:m/z300～2 000;分辨率:35 000。

1.3.2UPLC-QqQ-MS條件

色譜條件:采用1.3.1節(jié)相同色譜柱。流動相A為0.1%甲酸-水溶液,流動相B為0.1%甲酸-乙腈溶液。液相梯度洗脫程序:0～2 min,95%A;2～14 min,95%A～55%A;14～17 min,55%A;17～20 min,95%A。流速:0.3 mL/min。進樣體積:10 μL;柱溫:40 ℃。

質(zhì)譜條件:ESI源,采用正離子模式;加熱氣:空氣,15 mL/min;霧化氣:氮氣,15 mL/min;干燥氣:氮氣,15 mL/min;碰撞氣:氬氣;源溫度:300 ℃;脫溶劑管(desolvation line,DL)溫度:250 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;制冷氣溫度:15 ℃;掃描范圍:m/z50～2 000;駐留時間:30 ms;延遲時間:3 ms。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1蛋白質(zhì)提取條件優(yōu)化

由于水產(chǎn)品中含有一定的油脂,為了不影響后續(xù)的酶解效果以及質(zhì)譜分析,除酯是前處理的必要步驟。除酯后一般選擇pH=8.0左右的緩沖鹽溶液,于60 ℃水浴振蕩提取數(shù)小時,得到過敏原蛋白質(zhì)的粗提液,某些情況下需加入一定濃度的尿素和硫脲以增加蛋白質(zhì)的溶解度,提高提取效率[21,22]。本文考察了除酯試劑A(正己烷)和除酯試劑B(三氟乙酸(TFA)-氯仿(4∶1,v/v))、提取試劑C(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0±0.2))和提取試劑D(6 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0±0.2))交叉組合后的提取效果。交叉組合后得到4種前處理方法,分別為A+C、A+D、B+C和B+D。根據(jù)高分辨質(zhì)譜檢測特征肽段的響應值數(shù)據(jù)進行比較分析,觀察各肽段提取離子流色譜圖峰面積變化情況,如圖1所示,每條肽段平行檢測3次,取平均值,當前處理方式選擇B+C,即用三氟乙酸(TFA)/氯仿(4∶1,v/v)除脂、50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0±0.2)提取時,各過敏原特征肽段的檢測濃度可達到最高值,不僅操作簡單,還減少了鹽類物質(zhì)對儀器的損害,適用于水產(chǎn)品的前處理。因此本研究選擇三氟乙酸(TFA)/氯仿(4∶1,v/v)作為除酯試劑,50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8.0±0.2)作為提取試劑。

圖1 不同前處理對5種特征肽段提取率的影響(n=3)Fig.1 Effects of different pretreatments on the extraction ratios of the five marker peptides (n=3) A:n-hexane;B:trifluoroacetic acid-trichloromethane (4∶1,v/v);C:50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0±0.2);D:6 mol/L urea,2 mol/L thiourea,50 mmol/L Tris-HCl (pH=8.0±0.2).

2.1.2蛋白質(zhì)酶解條件優(yōu)化

對于復雜的食品基質(zhì)來說,酶解效率受多重因素的影響,要保證酶解效率需全面優(yōu)化并嚴格控制各實驗條件。在前期的工作中,對影響酶解條件的因素包括酶解時間、酶解促進劑等進行了考察和優(yōu)化[22,23]。本工作在前期工作的基礎上,對酶解時酶和蛋白質(zhì)的量進行了優(yōu)化,用Bradford試劑盒測定蛋白質(zhì)提取液的總濃度,按照酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶50、1∶100考察了加酶量對酶解效果的影響,結(jié)果表明,當酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1∶30時,酶解效果最佳。同時,為保證酶解效率的一致性,減小基質(zhì)效應對酶解效率的影響,選用空白基質(zhì)提取液配制系列標準溶液。經(jīng)過優(yōu)化后,對目標水產(chǎn)品過敏原蛋白進行了實驗驗證,相同濃度的標準溶液和基質(zhì)加標溶液相應肽段的峰面積偏差<10%(n=6)。

2.2 特征肽段

2.2.1物種特征肽段的選擇

本研究充分利用Q-Exactive高分辨質(zhì)譜的優(yōu)勢,采用Full MS/dd-MS2掃描模式對酶解后的樣品進行全掃描,結(jié)合二級碎片離子譜的分析,可以實現(xiàn)在沒有標準品的情況下,對樣品有無過敏原進行精確鑒定。通過ProteinPilot軟件(Version 5.0,AB SCIEX)結(jié)合蛋白質(zhì)檢索數(shù)據(jù)庫Uniprot,對采集的數(shù)據(jù)和肽段理論碎片的匹配度進行驗證,根據(jù)特征肽段的選擇原則[14,20],篩選出可能的特征肽段。最后將備選特征肽段通過BLASTP(http://www.uniprot.org/blast/)搜索實現(xiàn)對種屬特征性多肽的篩選[24,25]。由于食物過敏原蛋白在加熱、蒸煮或焙烤過程中會發(fā)生成環(huán)、氧化、交聯(lián)等各種副反應,如果特征肽段選擇的不合適、不穩(wěn)定,將會影響定性和定量結(jié)果。因此,在選取特征肽段時,優(yōu)先選擇不含漏切位點、不含甲硫氨酸、不含NXS/T的糖基化基序、不成環(huán)、無氧化、沒有任何蛋白質(zhì)修飾的肽段,從而確保特征肽段的穩(wěn)定性。依據(jù)肽段的選擇條件和豐度信息,選取大閘蟹、青蟹、南美白蝦、金槍魚和大西洋鮭魚多條特征肽段(不含漏切位點、不含甲硫氨酸、不含NXS/T的糖基化基序)。

二級質(zhì)譜鑒定中,多肽經(jīng)過電噴霧電離主要產(chǎn)生N端碎片離子(b離子)和C端碎片離子(y離子)。以金槍魚特征肽段LVVIESDLER(m/z960.5)為例,如圖2所示,圖中紅色和綠色譜線分別代表理論y離子和b離子的碎片峰,藍色譜線代表實驗獲得的離子碎片峰,可以看出,實驗獲得的譜圖和預測的碎裂模式之間有良好的對應關系,預期的18個b、y碎片離子中有17個得到鑒定,試驗結(jié)果與理論預測的碎裂模式高度匹配并顯示了很高的置信度,證明該肽段可用于MRM進一步分析。

利用本方法篩選出南美白蝦的13個特征肽段,分別屬于肌球蛋白和血藍蛋白;大閘蟹的5個特征肽段,屬于血藍蛋白;青蟹的3個特征肽段,屬于血藍蛋白;金槍魚的3個特征肽段,屬于原肌球蛋白;大西洋鮭魚的6個特征肽段,屬于小清蛋白,結(jié)果見表1。針對每個特征肽段,將Skyline軟件預測的離子對列表直接導到LabSolutions中進行初步的特征肽段驗證,將檢測結(jié)果導入Skyline軟件排查色譜峰,篩除未檢出肽段和未檢出子離子。根據(jù)肽段的碎裂模式,氨基酸序列相近的肽段之間存在較多的相互干擾[10],影響定性和定量結(jié)果的準確性。肽段的MS/MS碎片匹配的越多,定性準確度越高[26]。為盡可能消除干擾,針對每個肽段至少選擇6個b、y離子對用于定性確證,選擇3個干擾最少、響應最高的子離子進行定量檢測(見表1)。

圖2 金槍魚特征肽段LVVIESDLER(m/z 960.5)的碎片離子排布實驗結(jié)果與理論對比圖Fig.2 Product ion mass spectrum of the precursor ion at m/z 960.5 assigned to the Thunnus thynnus LVVIESDLER peptide corresponding to the predicted fragmentation patterns

表1 南美白蝦、大閘蟹、青蟹、金槍魚、大西洋鮭魚的特征肽段及MRM參數(shù)Table 1 Marker peptides and MRM parameters for Penaeus vannamei,Eriocheir,Scylla serrata,Thunnus thynnus,and Atlantic salmon

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

CE:collision energy.* Quantitative ion.

圖3 金槍魚特征肽段LVVIESDLER的質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization results of mass spectrometry condi-tions of the Thunnus thynnus LVVIESDLER peptide a.heating gas flow;b.nebulizing gas flow;c.interface temperature;d.desolvation line temperature;e.interface pressure;f.collision energy.

2.2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

目標蛋白質(zhì)的定量檢測主要采用MRM方式,它的顯著優(yōu)點是具有較高的靈敏度和特異性,能夠在復雜的基質(zhì)中對微量靶蛋白質(zhì)進行精確測定。為提高檢測靈敏度并增強系統(tǒng)穩(wěn)定性,首先優(yōu)化各質(zhì)譜條件。利用島津LC-MS/MS自帶的Interface軟件,生成優(yōu)化氣流量、溫度和電壓的采集方法,利用Skyline軟件自動生成優(yōu)化碰撞能的采集方法。以金槍魚特征肽段LVVIESDLER離子通路586.829 7(2+)為例,本工作考察了加熱氣流量、霧化氣流量、接口溫度、DL溫度、接口壓力和碰撞能量(CE)對信號響應強度的影響。當質(zhì)譜加熱氣流量分別為5、10和12 L/min時,結(jié)果如圖3a所示,加熱氣流量為12 L/min時,響應強度最佳。當質(zhì)譜霧化氣流量分別為1.5、2.0、2.5和3.0 L/min時,結(jié)果如圖3b所示,霧化氣流量為3 L/min時,響應強度最佳。當質(zhì)譜接口溫度分別為200、250、300和350 ℃時,結(jié)果如圖3c所示,接口溫度為250 ℃時,響應強度最佳。當質(zhì)譜DL溫度分別為150、200、250和300 ℃時,結(jié)果如圖3d所示,DL溫度為200 ℃時,響應強度最佳。當質(zhì)譜接口壓力分別為0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 kV時,結(jié)果如圖3e所示,接口壓力為2.0 kV時,響應強度最佳。當質(zhì)譜碰撞能量分別為8.0、11.0、14.0、17.0、20.0、23.0、26.0、29.0、32.0、35.0和38.0 V時,結(jié)果如圖3f所示,碰撞能量為20.0 V時,響應強度最佳。從結(jié)果可以看出,當加熱氣流量為12 L/min、霧化氣流量為3 L/min、接口溫度為250 ℃、DL溫度為200 ℃、接口壓力為2.0 kV、碰撞能量為20.0 V時肽段響應強度最高,在該條件下生成最終的MRM定量方法。其余各肽段均采用上述方式對質(zhì)譜條件進行逐一優(yōu)化,優(yōu)化后的MRM方法中各物種特征肽段離子對信息如表1所示,優(yōu)化后各物種特征肽段的提取離子色譜圖見圖4。

圖4 南美白蝦、大閘蟹、青蟹、金槍魚、大西洋鮭魚特征肽段的提取離子流色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatograms for the selected marker peptides of Penaeus vannamei,Eriocheir,Scylla serrata,Thunnus thynnus,and Atlantic salmon

2.3 方法學驗證

水產(chǎn)品中魚蝦蟹為常見的過敏原產(chǎn)品,采用本方法對水產(chǎn)品過敏原檢測進行了定量研究,考察5種水產(chǎn)品的檢出限、定量限、回收率等。由于過敏原蛋白標準品的缺乏,在定量研究中,參考文獻[8,10]報道,選擇致敏物質(zhì)的蛋白質(zhì)提取液作為標準品,濃度以致敏物質(zhì)的含量表示。后續(xù)定量結(jié)果也是以致敏物質(zhì)的含量表示,而不是某一種過敏原蛋白的含量。針對每個物種,分別選擇響應強度最高的一個特征肽段進行方法學考察,如表2和表3所示,每個特征肽段對應的定量離子參見表1。

表2 南美白蝦、金槍魚、大西洋鮭魚、青蟹和大閘蟹的5個特征肽段的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)(r2)、檢出限和定量限Table 2 Linear range,linear equations,correlation coefficients (r2),LOD and LOQ of the five marker peptides of Penaeus vannamei,Eriocheir,Scylla serrata,Thunnus thynnus,and Atlantic salmon

Y:peak area;X:mass percentage,%.

表3 南美白蝦、金槍魚、大西洋鮭魚、青蟹和大閘蟹的5個特征肽段的平均回收率和日內(nèi)精密度、日間精密度Table 3 Average recoveries,intra-day RSDs,and inter-day RSDs of the five marker peptides of Penaeus vannamei,Eriocheir,Scylla serrata,Thunnus thynnus,and Atlantic salmon

2.3.1方法的線性關系、定量限和檢出限

從1.1節(jié)制備的標準儲備液中分別取5種樣品的蛋白質(zhì)提取儲備液,用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋至5、10、25、50、75、100和250 mg/kg,酶解,分別以質(zhì)量濃度為橫坐標,以所選取的特征肽段峰面積為縱坐標制作標準曲線。結(jié)果如表2所示,5種特征肽段在5～250 mg/kg內(nèi)呈良好的線性關系,各標準曲線相關性系數(shù)均大于0.99。以3倍和10倍信噪比(S/N)確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),南美白蝦、金槍魚、大西洋鮭魚和大閘蟹的檢出限和定量限分別為2和5 mg/kg,青蟹的檢出限和定量限分別為3.5和10 mg/kg。

2.3.2回收率和精密度

為了驗證方法的準確性和重現(xiàn)性,在空白肉類樣品基質(zhì)中分別添加1、2、5和10倍LOQ水平的蛋白質(zhì)提取液,酶解后用質(zhì)譜檢測,采用標準曲線定量計算加標回收。測定日內(nèi)精密度時,每個水平單獨加標3次,按照樣品前處理步驟進行酶解后,每份樣品進樣檢測3次;測定日間精密度時,連續(xù)測定3天中,每個水平加標1次,酶解后,每個樣品平行檢測3次。結(jié)果見表3,平均加標回收率為88.7%～110.2%,日內(nèi)精密度不大于8.2%,日間精密度不大于13.1%,證明該方法具有較高的準確度和穩(wěn)定性,使用該方法能夠較為可靠地測定水產(chǎn)品中5種所選過敏原成分的含量。

2.4 實際樣品檢測

為驗證所建立分析方法的適用性,確保本方法可以應用于實際樣品的檢測,在市場上選購45種肉制品和調(diào)味料樣品,通過MRM方法檢測不同商品中是否含有7種水產(chǎn)品過敏原。由于實際樣品的復雜性,蛋白質(zhì)定性要同時滿足兩個條件:對于每種蛋白質(zhì),表1列出的所有特征肽段都要有檢出;對于每個特征肽段,至少有6個b、y離子匹配上。對可能存在的過敏原蛋白進行定性確證后,再進行定量檢測。結(jié)果見表4。在未明確標明致敏信息的商品中,有5種肉制品、6種調(diào)味料均檢測出了水產(chǎn)品過敏原。

表4 5種特征肽在45種市售食品中的測定Table 4 Determination of the five types of marker peptides in 45 commercial foods

表4 (續(xù))Table 4 (Continued)

-:not detected.

3 結(jié)論

本文建立了一種同時檢測食品中多種水產(chǎn)品過敏原的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法,結(jié)合UPLC-Q/Exactive-HRMS和UPLC-QqQ-MS,共篩選出5種水產(chǎn)品中7種過敏原蛋白的30個特征肽段,并且建立了以特征肽段為分析對象的食品中水產(chǎn)品過敏原的定量檢測方法。該方法重現(xiàn)性好、通量高,能同時對肉制品和調(diào)味料中的南美白蝦、金槍魚、大西洋鮭魚、青蟹和大閘蟹中的7種過敏原進行快速篩查和定量分析。本方法采用經(jīng)典蛋白質(zhì)組學原理進行過敏原檢測,為水產(chǎn)品過敏原的確證和定量提供了可靠的技術平臺,可作為傳統(tǒng)ELISA、PCR方法的有益補充。