高 健,李祥鵬,石彥國,王 冰,劉琳琳,張 娜

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江省食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

蛋白質(zhì)是食品中重要的組分之一,是衡量食品營養(yǎng)價值的重要目標,其氨基酸殘基線性鏈折疊成具有生物活性的復雜的空間立體三維結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)上的特點對加工特性具有重要的作用。Ohgushi等[1]和Wada首次發(fā)現(xiàn)并證明，馬細胞色素C在低pH或者變性劑存在的條件下,在折疊與去折疊的過程中形成一種新的結(jié)構(gòu)狀態(tài),并將其命名為“熔球態(tài)”,熔球態(tài)結(jié)構(gòu)具有與天然態(tài)相似的二級結(jié)構(gòu)與特性粘度,但是缺少由側(cè)鏈產(chǎn)生的特定的三級結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子的半徑比天然狀態(tài)大10%～30%,結(jié)構(gòu)中存在的松散堆積的疏水核心,使得疏水表面積比天然態(tài)有所增加[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的熔球態(tài)結(jié)構(gòu)具有更加良好的溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性、酶消化能力及抗氧化活性[4-5],可應(yīng)用于食品產(chǎn)品中,因此,對熔球態(tài)蛋白質(zhì)進行相關(guān)研究具有深遠的意義。本文對蛋白質(zhì)折疊與去折疊過程中的熔球態(tài)的結(jié)構(gòu)特點進行討論,并將系統(tǒng)闡述部分球蛋白熔球態(tài)的誘導方法,指出熔球態(tài)蛋白的加工特性與部分功能性。

1 蛋白質(zhì)折疊與去折疊過程中的中間態(tài)

早期的研究認為蛋白質(zhì)折疊與去折疊的過程中不存在中間態(tài),是一種“突變”過程,通常用二態(tài)模型表示。但Levinthal悖論中提出,多肽鏈中可能存在大量的天然構(gòu)象,蛋白質(zhì)必須通過一系列中間體折疊途徑然后形成天然結(jié)構(gòu)[6],Ptitsyn[7]在此基礎(chǔ)上提出的“框架模型”進一步證明蛋白質(zhì)折疊至少包括三個階段(圖1),第一階段:在展開的鏈中形成波動二級結(jié)構(gòu),構(gòu)成該結(jié)構(gòu)的鍵主要是肽鏈的氫鍵;第二階段:將之前的存在波動的二級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)合并為中間球狀結(jié)構(gòu),構(gòu)成該結(jié)構(gòu)的主要的力是疏水相互作用;第三階段:將中間結(jié)構(gòu)調(diào)整到最終的特定天然三級結(jié)構(gòu),這個階段主要的力為范德華力。Kuwajima等人與Ikeguchi等人通過圓二色譜(CD)測量α-乳白蛋白的去折疊中間態(tài)和鹽酸胍誘導的α-乳白蛋白重折疊動力學的瞬時折疊中間態(tài)表現(xiàn)出相同的狀態(tài)[8-9],而且有多項研究證明α-乳白蛋白[10-12]和脫輔基肌紅蛋白[13-14]的去折疊過程中觀察到的熔球態(tài)與各自重新折疊過程中形成的熔球態(tài)極為相似。并且在薩楚爾夫等人研究β-乳球蛋白重折疊的動力學特征中發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)折疊和去折疊過程與二態(tài)模型描述的過程并不相符,蛋白質(zhì)折疊與去折疊過程是經(jīng)歷許多中間態(tài)的構(gòu)象漸變過程[15],熔球態(tài)是蛋白質(zhì)折疊與去折疊構(gòu)象漸變過程的一種中間態(tài)[16]。Cleland等[17]在研究牛碳酸酐酶B重折疊過程發(fā)現(xiàn),去除復性劑或降低復性劑濃度后,變性蛋白從伸展態(tài)迅速卷曲形成第一中間態(tài),即熔球態(tài),在這種狀態(tài)下,蛋白的疏水基團暴露于蛋白的表面,這一過程約在數(shù)百毫秒內(nèi)就完成了,之后熔球態(tài)蛋白表面的疏水性殘基向蛋白內(nèi)部折疊形成疏水核心,即轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙虚g態(tài),這一過程相對緩慢,大約為數(shù)百秒。不論是變性還是復性的過程,熔球態(tài)蛋白過渡到其下一個狀態(tài)的速度都相對緩慢,整個過程受到動力學的控制。

圖1 Ptitsyn提出的“框架模型”Fig.1 “Framework model” proposed by Ptitsyn

2 熔球態(tài)蛋白的結(jié)構(gòu)特點

球形蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,三級結(jié)構(gòu)是氫鍵、離子鍵、二硫鍵等力的作用下,在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進一步折疊卷曲形成復雜緊密的接近球形或橢球形的三維空間分子結(jié)構(gòu)。球蛋白結(jié)構(gòu)具有如下特點:a.都含有二硫鍵、游離巰基,以保證該蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定(部分球蛋白中二硫鍵與巰基數(shù)量如表1所示);b.含有胱氨酸和半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)混合物能發(fā)生巰基-二硫鍵交換反應(yīng)及巰基氧化反應(yīng),巰基-二硫鍵交換反應(yīng)通常導致蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性降低。經(jīng)過變性條件處理后,疏水基團暴露,如在極端堿性或酸性pH條件下,球蛋白部分展開,增加分子內(nèi)帶電側(cè)鏈基團之間的排斥,形成更為柔韌的結(jié)構(gòu),即熔球態(tài)結(jié)構(gòu)蛋白[18]。

表1 部分球蛋白二硫鍵與巰基的數(shù)量Table 1 The number of partial globulin disulfide bonds and sulfhydryl groups

表征熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的常規(guī)技術(shù)包括:

a.檢測蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)的圓二色譜。如Vassilenko等[19]通過分析天然狀態(tài)和pH誘導的九種蛋白質(zhì)的熔球態(tài)的遠紫外CD光譜得出熔球態(tài)下蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)接近于天然狀態(tài)。Kumari等[20]發(fā)現(xiàn)在pH為2.0時使用十二烷基硫酸鈉對絲氨酸蛋白酶進行誘導處理可以得到一個具有與天然狀態(tài)二級結(jié)構(gòu)相似,含有大量的疏水表面且沒有剛性的三級結(jié)構(gòu)的中間狀態(tài)。

b.檢測蛋白質(zhì)粒徑、分子大小的流體力學技術(shù)如粘度測量和分子排阻色譜。蛋白質(zhì)的粒徑,分子大小,粘度等指標也反映出了蛋白質(zhì)的緊密性,熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是緊湊的,近似于天然態(tài)的蛋白質(zhì)。如Dolgikh等[21]通過測定牛乳和人乳中的α-乳白蛋白在酸、溫度處理下的熔球態(tài)以及完全變性呈展開態(tài)的特性黏度發(fā)現(xiàn),酸處理或熱處理的α-乳白蛋白熔球態(tài)的特性黏度在3～4 cm3/g,與天然態(tài)(3.1～3.4 cm3/g)非常接近;而去折疊態(tài)是6.1～6.6 cm3/g。Dar等[22]用尿素誘導綿羊血清白蛋白形成熔球態(tài)蛋白,通過動態(tài)光散射法測得綿羊血清白蛋白天然態(tài)、熔球態(tài)和完全變性態(tài)的流體力學半徑分別為3.60、6.73、11.00 nm。

c.檢測蛋白質(zhì)松散疏水基團的形成的疏水染料(ANS)結(jié)合實驗。熔球態(tài)蛋白具有一定柔性,內(nèi)部的一些非極性基團暴露在溶劑中,從而表現(xiàn)出疏水表面積比天然狀態(tài)蛋白質(zhì)更大。ANS是一種熒光疏水染料,用于監(jiān)測折疊和展開過程中蛋白質(zhì)疏水表面的暴露情況[23-24]。它對蛋白質(zhì)中間狀態(tài)的親和力高于天然或完全未折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)[2,25-26]。Dave等[27]在研究堿性條件誘導莖菠蘿蛋白酶發(fā)現(xiàn)ANS熒光在pH7～9時沒有變化,但在pH10.0時突然出現(xiàn)三倍的峰值,隨著pH的進一步升高消除了酶與ANS的結(jié)合,這些結(jié)果表明在pH10.0條件下莖菠蘿蛋白酶中存在大量溶劑可及的疏水表面,證實在pH10.0下出現(xiàn)莖菠蘿蛋白酶的熔球態(tài)結(jié)構(gòu)。

熔球態(tài)蛋白的穩(wěn)定性是決定其應(yīng)用的重點,有研究人員在誘導熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的同時添加一些外源性物質(zhì)來穩(wěn)定熔球態(tài)結(jié)構(gòu),確保該結(jié)構(gòu)可以穩(wěn)定長時保存。在極端pH下,可通過鹽[28-31]、糖、多元醇[32-35]穩(wěn)定熔球態(tài)蛋白,并將酸變性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為熔球態(tài)[36-37]。同時也有蛋白質(zhì)在中性pH條件下添加變性劑(尿素)[38]或大分子擁擠劑形成穩(wěn)定的熔球態(tài)蛋白[39-41]。

3 部分球蛋白的熔球態(tài)的誘導方法

3.1 肌紅蛋白

近年來,一些研究針對肌紅蛋白熔球態(tài)結(jié)構(gòu),尤其是大分子擠壓誘導肌紅蛋白形成熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的方法逐漸得到重視,用大分子擁擠劑模擬出一個擁擠的環(huán)境,當體系中存在大分子擁擠劑時,大分子之間遵循分子排斥容積理論,會促使蛋白質(zhì)向體積減小的方向,既結(jié)合方向移動,變性程度降低,使熔球態(tài)蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。大量研究表明,高濃度的擁擠劑使得折疊和部分折疊的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)含量增加,并且穩(wěn)定性也隨之增強[42-48]。目前發(fā)現(xiàn)聚蔗糖70(菲可70)、聚乙二醇、葡聚糖等作為大分子擁擠劑可促進熔球態(tài)肌紅蛋白穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的形成[40-41,49]。在這些大分子擁擠劑作用下,肌紅蛋白均呈現(xiàn)出熔球態(tài)的結(jié)構(gòu)特征,菲可70和聚乙二醇都是通過與肌紅蛋白的血紅素相互作用誘導肌紅蛋白成熔球態(tài)構(gòu)象[40-41]。與天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)相比,通過聚乙二醇作用下的熔球態(tài)具有疏水區(qū)域和更大的流體動力學體積[41]。而且有研究發(fā)現(xiàn)在pH2.0時,鹽濃度或葡聚糖濃度的增加,會導致熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的增加[49]。另外,還有通過添加變性劑誘導肌紅蛋白形成熔球態(tài)結(jié)構(gòu)[50],他們所使用的變性劑2,2,2-三氟乙醇(TFE)是極性較小、疏水性較強的溶劑,可破壞疏水相互作用,并可作為三級結(jié)構(gòu)的變性劑,在一定pH環(huán)境與變性劑濃度條件下,可誘導肌紅蛋白成熔球態(tài)蛋白。

3.2 乳蛋白

多種方式均可誘導乳蛋白形成熔球態(tài)。在對于α-乳白蛋白的研究發(fā)現(xiàn),在極端pH,熱處理、去除結(jié)合的Ca2+、添加變性劑(如尿素,鹽酸胍)的方法可以誘導α-乳白蛋白達到穩(wěn)定熔球態(tài)結(jié)構(gòu),并誘導出熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的表面疏水性增加[51-53,24]。通過核磁共振光譜學分析發(fā)現(xiàn),由尿素誘導的牛α-乳白蛋白與人α-乳白蛋白的熔球態(tài)展開的殘基的特異性信息是一致的,但牛α-乳白蛋白與人α-乳白蛋白相比,在相同的pH環(huán)境和溫度環(huán)境下,牛α-乳白蛋白需要添加比較少的變性劑即可誘導成熔球態(tài),說明牛α-乳白蛋白的抗展開能力較弱,比人α-乳白蛋白更容易形成熔球態(tài)結(jié)構(gòu)[53]。對于β-乳球蛋白熔球態(tài)的研究,使用酸、熱或者酸熱協(xié)同處理的方法誘導熔球態(tài)比較多[54-57]。β-乳球蛋白在67.5 ℃的聚集過程中顯示出典型的熔球態(tài)特征,但是仍然有一部分處于變性狀態(tài)[36],在85 ℃加熱5 min后4 ℃冷卻1 h，β-乳球蛋白的Cys 119單體顯示出分子重排形成非天然二硫鍵鏈接的熔球態(tài)[54]。Yamamoto等[56]用核磁共振法分析發(fā)現(xiàn),馬的β-乳球蛋白在經(jīng)過低pH(pH<4.0)的條件處理后,其呈現(xiàn)出熔球態(tài)構(gòu)象。Tavel等[57]用酸熱協(xié)同處理方法發(fā)現(xiàn) pH2.59條件下80 ℃熱處理誘導天然β-乳球蛋白轉(zhuǎn)化成熔球狀態(tài)。還有通過高壓與熱聯(lián)合處理的方法誘導β-乳球蛋白的形成,在600 MPa/50 ℃和294 MPa/62 ℃聯(lián)合作用誘導β-乳球蛋白形成一種含有α-螺旋的熔球結(jié)構(gòu)[58-59]。對于高壓誘導深入研究發(fā)現(xiàn),由于α-乳白蛋白本身缺少游離巰基,所以本質(zhì)上不易受高壓誘導,所以在200 MPa時,才能形成可復性的熔球態(tài)結(jié)構(gòu),在400 MPa發(fā)生不可逆的變性,而β-乳球蛋白則是在50 MPa條件下才可形成熔球態(tài)結(jié)構(gòu),150 MPa發(fā)生不可逆的變性[60-62]。

3.3 植物蛋白

大多采用pH偏移方法處理形成熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的植物蛋白,大多數(shù)植物中的蛋白質(zhì)具有由多個亞基組成的緊密結(jié)構(gòu),當?shù)鞍踪|(zhì)分子處于極端pH條件時,生成高度帶電結(jié)構(gòu)(氨基質(zhì)子化和羧基的去質(zhì)子化),促進分子電荷排斥,然后調(diào)整至中性使分子內(nèi)電荷排斥大大減少,發(fā)生一定程度的重折疊,四元結(jié)構(gòu)被破壞并且單個單體獲得熔球態(tài)。蔣將等[63-64]利用這一性質(zhì)研究了pH偏移處理對大豆分離蛋白(SPI)、β-伴球蛋白(7S)和球蛋白(11S)的二、三級結(jié)構(gòu)的影響。經(jīng)極端pH(1.5和12.0)偏移處理后，SPI基本維持原二級結(jié)構(gòu)但失去大部分三級結(jié)構(gòu),可認為此改性SPI處于熔球態(tài)。經(jīng)pH12.0偏移處理后,豌豆蛋白處于熔球態(tài),二級結(jié)構(gòu)部分展開[65]。Alam等[66]確認了大豆凝集素在酸性pH2.2形成熔球態(tài),并添加半乳糖來探究對大豆凝集素熔球態(tài)穩(wěn)定性的影響,在pH2.2下,50 mmol/L半乳糖穩(wěn)定了大豆凝集素的二級結(jié)構(gòu)。

4 熔球態(tài)蛋白質(zhì)的加工特性

熔球態(tài)蛋白在溶解性、乳化性、起泡性、凝膠性、酶消化能力及抗氧化活性方面展現(xiàn)了良好的作用效果[4-5]。蔣將研究了pH1.5與pH12.0偏移處理大豆蛋白形成熔球態(tài)蛋白質(zhì)的溶解性,發(fā)現(xiàn)經(jīng)過pH1.5與pH12.0偏移處理后,在不同的離子強度下,溶解度曲線發(fā)生了改變,對于大豆分離蛋白、11S蛋白,處理后的樣品溶解度增加,并且在低鹽溶液中,極端堿性偏移處理溶解性增大顯著,但是對于偏移誘導后的7S蛋白,影響不大[62]。相似的,pH12.0偏移處理和超聲聯(lián)合工藝成功地提高了豌豆蛋白的溶解度,并顯著降低了可溶性蛋白質(zhì)聚集體的大小[65]。pH偏移處理后,大豆蛋白成為熔球態(tài)結(jié)構(gòu),保持了原有的二級結(jié)構(gòu)和整體致密性,但三級結(jié)構(gòu)松散,表面疏水性增加。這些結(jié)構(gòu)的改變導致SPI的乳化活性及乳化穩(wěn)定性顯著改善[67]。7S的乳化性適度提高,但是11S對pH偏移處理更敏感,尤其是pH12.0偏移處理,也說明偏移處理后11S乳化性的增加決定 SPI乳化性的變化[64],證明富含大豆球蛋白的SPI特別適用于在生產(chǎn)中作為食品表面活性功能成分。同樣的處理方法也適用于豌豆蛋白,堿性pH偏移處理改善了豌豆蛋白的乳化性[68]。

目前研究駱駝中乳蛋白形成熔球態(tài)蛋白功能性質(zhì)的研究比較多,Lajnaf等[69]利用了熔球態(tài)結(jié)構(gòu)的特性研究了pH(4.3和6.5)和熱處理(70 ℃和90 ℃,30 min)對駱駝乳中α-乳白蛋白起泡性和界面性質(zhì)的影響,高溫處理改變了駱駝α-乳白蛋白溶液的起泡特性和在空氣-水界面展開的能力。在中性pH下,發(fā)現(xiàn)熱處理改善了起泡性,而在酸性(pH4.3)條件下，該性質(zhì)降低。由于在低pH下蛋白質(zhì)聚集的水平較高,泡沫在pH4.3的熱處理之后比在pH6.5更穩(wěn)定。在90 ℃熱處理30 min,通過增加游離巰基濃度，在pH6.5下影響駱駝乳白蛋白的物理化學性質(zhì),熱處理也引起α-乳白蛋白表面電荷的變化[69]。Salami[5]報道了可用于嬰幼兒配方粉的天然狀態(tài)下和熔球態(tài)的駱駝α-乳白蛋白,并評價了酶消化和抗氧化活性,并與牛α-乳白蛋白進行對比,發(fā)現(xiàn)駱駝蛋白質(zhì)比牛蛋白質(zhì)更快水解和更大的抗氧化活性。

對于混合蛋白體系,熔球態(tài)的大豆蛋白作為輔料添加到其他產(chǎn)品中也有其他功能性質(zhì)的改善。Niu等[70]研究了pH1.5與60 ℃加熱誘導的大豆蛋白分離物與肌原纖維蛋白混合物的凝膠化和流變學特性。與天然大豆蛋白分離物相比,加入酸熱誘導的大豆分離蛋白之后,凝膠滲透力,儲能模量值和損耗模量值顯著增加,并且提高了體系凝膠的保水性。適用于生產(chǎn)粉碎的肉制品[70]。蔣將等人研究了pH偏移處理大豆蛋白將其添加到肉蛋白中,觀察能否對肉蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)起到支撐作用和提高其持水性及乳化性。發(fā)現(xiàn)與單純的肌原纖維分離蛋白凝膠相比,未經(jīng)處理的大豆分離蛋白添加進去后降低了混合凝膠的強度,隨著大豆分離蛋白添加量的增加,凝膠強度明顯降低。但是經(jīng)過pH偏移處理之后的大豆分離蛋白大豆蛋白亞基發(fā)生解離,有助于大豆分離蛋白和肌原纖維分離蛋白亞基相互作用,促進凝膠形成[64]。類似的研究發(fā)現(xiàn)pH1.5偏移結(jié)合60 ℃加熱處理5 h的大豆蛋白與肌原纖維蛋白按照質(zhì)量比1∶12、1∶6、1∶4復配,肌原纖維蛋白的溶解度隨比例增加而增大,濁度降低[71]。

5 結(jié)語

隨著經(jīng)濟的發(fā)展與人們對良好產(chǎn)品的訴求,蛋白質(zhì)產(chǎn)品已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),良好的加工特性必然成為食品工業(yè)著重關(guān)注的對象。熔球態(tài)蛋白作為一個良好功能性表達的載體,已然成為優(yōu)良的研究對象,但是現(xiàn)在仍有一部分蛋白質(zhì)的熔球態(tài)結(jié)構(gòu)表述不夠完善,對于其亞基水平和結(jié)構(gòu)成鍵角度的方向缺少更加細致的描述;當其被用于食品行業(yè)時,缺少更經(jīng)濟的熔球態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定劑;無法確認熔球態(tài)結(jié)構(gòu)與部分加工特性的關(guān)系?；谌矍驊B(tài)蛋白對于食品工業(yè)發(fā)展的益處,進行相關(guān)研究更具有深遠的意義,也將成為未來的發(fā)展趨勢。