葉磊海,裘均陶,鐘世歡,趙紅波,王慶玲,葉佳明,詹越城,楊 娜

(1.浙江公正檢驗中心有限公司,浙江杭州 310009; 2.贊宇科技集團股份有限公司,浙江杭州 310009)

生物胺(BAs)是一類具有生物活性含氮的低分子量有機化合物的總稱,廣泛存在于富含氨基酸和蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品中,主要包括組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、章魚胺等。生物胺是人體內(nèi)正常的活性成分,維持著內(nèi)臟功能和免疫系統(tǒng)的代謝活動,在生物活性細胞中發(fā)揮著重要作用[1],適量的生物胺對人體有益,但過量的生物胺會對人體產(chǎn)生毒害作用。事實上,由生物胺導(dǎo)致的中毒事件時有發(fā)生,2010年,張家港市員工因食用不清潔青占魚導(dǎo)致集體食物中毒;2013年,深圳市某食堂因進食不潔鮐魚引發(fā)食物中毒,調(diào)查結(jié)果均證實不是由致病菌引起的,而是由變質(zhì)魚肉中所含的高含量組胺引起的。水產(chǎn)品的生物胺主要是在微生物作用下,游離氨基酸在氨基酸脫羧酶作用下脫去羧基形成的產(chǎn)物,其中以組胺、酪胺毒性最大,目前已把生物胺含量作為評價水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)。

目前,國內(nèi)外檢測生物胺類物質(zhì)的方法主要有薄層色譜法[2]、免疫分析法[3]、氣相色譜法[4]、離子色譜法[5]、高效液相色譜法[6-10]和液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法[11-14]。其中高效液相色譜法是目前檢測此類物質(zhì)最廣泛的方法,但是由于生物胺極性很強,在C18柱上保留很弱,且大部分物質(zhì)在可見和紫外波長范圍內(nèi)無明顯吸收,也無熒光成分[15],需要通過柱前或柱后衍生,前處理步驟繁瑣,整個檢測周期長,且衍生物不穩(wěn)定,衍生后的圖譜雜質(zhì)較多,給目標(biāo)物的定性和定量檢測帶來很大的難度。

本研究擬運用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,通過優(yōu)化提取和凈化方法以及色譜和質(zhì)譜條件,對不同水產(chǎn)品的生物胺進行了分析測定,并嘗試通過放置溫度和放置時間來分析影響水產(chǎn)品的主要生物胺指標(biāo),建立同時檢測9種生物胺的快速檢驗方法,以期為此類物質(zhì)的檢測提供更多的技術(shù)選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品:南美白對蝦、梭子蟹、大黃魚、甲魚、鯽魚等 農(nóng)貿(mào)市場抽取;組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、色胺、苯乙胺、章魚胺 純度≥98.0%,德國Dr.Ehrenstorfer;乙腈、甲酸、甲酸銨 色譜純，美國J.T.Baker;鹽酸 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

4500液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀 美國AB公司;SOP萬分之一電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;Supelco 24管固相萃取裝置 美國Supelco公司;固相萃取小柱 6cc/200 mg Oasis MAX、HLB、PriME HLB 美國沃特世公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別稱取25.0 mg上述標(biāo)準(zhǔn)品于25.0 mL容量瓶中,用0.1 mol/L鹽酸溶解,定容配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于4 ℃避光保存。分別量取1.0 mL,于100 mL容量瓶中,用定溶液定容至刻度,配制成濃度為10 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,實驗中根據(jù)需要配制標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理 稱取1.0 g混合均勻的樣品于50.0 mL離心管中,加入酸化乙腈8 mL,超聲提取10 min,10000 r/min離心5 min,用酸化乙腈8 mL重復(fù)提取殘渣1次,合并提取液并定容至20 mL,取上清液5 mL轉(zhuǎn)入PriME HLB固相萃取柱中(無需對PriME HLB進行活化),以1 滴/s的速度過柱,收集全部流出液后,在45 ℃下用氮氣吹至近干,并用乙腈-20 mmol/L甲酸銨溶液(用甲酸調(diào)至pH4.0,8∶2,V/V)定容溶液定容至1 mL,混勻過0.22 μm濾膜上機。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為WATERS HILIC柱(2.1 mm×50 mm,1.7(m),流動相:A:20 mmol/L甲酸銨(甲酸調(diào)pH為4.0),B:CH3CN,梯度洗脫程序:0～2 min,90%～80% B%,2～5 min,80%～75% B%,5～6 min,75%～40% B%,6～9 min,40%～40% B%,9～12 min,40%～90% B%。

流速:0.3 mL/min,溫度:30 ℃,進樣量:5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 掃描方式采用電噴霧正離子掃描(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);噴霧壓力50 psi;干燥氣流速10 L/min;干燥氣溫度550 ℃;毛細管電壓4500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇 由于水產(chǎn)品中基質(zhì)復(fù)雜,含有較高濃度的蛋白質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì),干擾目標(biāo)物的分析,在選擇提取溶液時必須能使蛋白質(zhì)變性沉淀,減少基質(zhì)影響。崔曉美等[13]選取乙腈-甲酸銨水溶液為提取劑,利用腈基固相萃取填料測定鰹魚中5種生物胺的含量,孫亞軍等[16]利用1%三氯乙酸做提取劑,來測定蝦仁中8種的生物胺等。結(jié)合文獻一般以鹽酸、高氯酸、三氯乙酸、乙腈或乙酸乙酯等溶劑為提取劑,考慮到強酸溶液如果沒有完全凈化,并且進行大批量樣品處理后進入質(zhì)譜會腐蝕儀器,再加上后續(xù)固相萃取柱的選擇,本實驗選擇考察乙腈、0.2%酸化乙腈和乙酸乙酯的提取效果。

本實驗分別考察了乙腈、0.2%酸化乙腈、乙腈-乙酸乙酯(1∶1)提取效率,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,分別用南美白對蝦、梭子蟹和大黃魚作為基質(zhì),0.2%酸化乙腈作為提取劑時回收率達到90%以上,均高于乙腈和乙腈-乙酸乙酯(1∶1),因而本實驗選擇0.2%酸化乙腈作為提取溶劑。實驗還發(fā)現(xiàn),用乙酸乙酯作為共萃劑時,雜質(zhì)較多,增加了后續(xù)凈化的難度,有乙腈存在的體系,雜質(zhì)較少,提取物干凈,主要是由于乙腈有更好沉淀蛋白的效果。

圖1 不同提取劑回收率比較Fig.1 Comparison of recovery rates of different extraction agents

2.1.2 萃取柱的選擇 本實驗采用Prime HLB萃取小柱進行樣品的凈化。本文對MAX、HLB以及PriME HLB固相萃取柱的保留效果進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用MAX有比較好的凈化和吸附能力,但是基質(zhì)效應(yīng)比較嚴(yán)重,離子抑制效應(yīng)較強;在普通HLB中很難保留,采用PriME HLB,可用酸化乙腈的提取液過柱,目標(biāo)物化合物通過小柱,水產(chǎn)品中磷脂、色素、脂肪等雜質(zhì)被吸附于萃取柱,這樣既能使干擾物有效去除,又確保了待測組分無損失,同時在凈化過程中省去了溶劑轉(zhuǎn)換的過程,簡化了操作步驟。同時比較了不同基質(zhì)中3種萃取小柱的回收率,發(fā)現(xiàn)在普通HLB中回收率最低,MAX回收率次之,在Prime HLB中回收率達到90%以上。通過比較,無論是實際凈化步驟的復(fù)雜程度,還是保留效果和回收率,PriME HLB都優(yōu)于其他兩種柱子。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

生物胺極性較強,在反相色譜柱中幾乎無保留,本研究嘗試選擇反相C18柱進行分離檢測,實驗發(fā)現(xiàn)大部分目標(biāo)物在色譜柱上沒有保留,出峰時間小于1 min,通過調(diào)節(jié)流動相組成和比例也沒有明顯改善,而 HILIC(親水作用色譜)固定相為硅膠,用于保留和分離強極性的堿性化合物,因此選擇HILIC色譜柱進行生物胺的分離。

HILIC常用來分析正離子的流動相主要是甲酸-乙腈或甲酸銨-乙腈,通過比較,以甲酸-乙腈為配比的流動相時,各目標(biāo)物出峰較早,分離效果不佳,而加入甲酸銨改性劑后能顯著增加目標(biāo)物在柱子上的保留,提高目標(biāo)物的響應(yīng),所以選擇甲酸銨-乙腈作為流動相。

進一步考察了5、10、20 mmol/L不同濃度的甲酸銨溶液作為流動相時各目標(biāo)物的分離情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-甲酸銨溶液(含20 mmol/L酸銨,調(diào)pH為4.0)作為流動相進行梯度洗脫可以兼顧9種生物胺色譜保留行為及質(zhì)譜響應(yīng),經(jīng)優(yōu)化后的梯度洗脫能有效分離9種化合物。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化用直接接二通方式進行,用0.1 mL/min的流速將生物胺注入電噴霧離子源,根據(jù)總離子流響應(yīng)值和分子離子峰響應(yīng)值的強度確定最佳質(zhì)譜參數(shù),主要對去簇電壓及碰撞能進行優(yōu)化,以去簇電壓和碰撞能為例,去簇電壓過小,會檢測不到信號,降低靈敏度,電壓過大會導(dǎo)致源內(nèi)裂解,同樣降低分子離子峰的豐度,而碰撞能的大小直接決定著能否獲得較高響應(yīng)的子離子,本實驗首先對目標(biāo)物進行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描),得到母離子質(zhì)量數(shù),優(yōu)化去簇電壓,保證母離子的傳輸效率;對母離子碰撞后,進行二級質(zhì)譜分析(Q3掃描),得到子離子質(zhì)譜圖,優(yōu)化碰撞能,然后在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下使用優(yōu)化好的去簇電壓和碰撞能進行測試,此外進一步優(yōu)化毛細管電壓,霧化器壓力,干燥器溫度和流速等質(zhì)譜參數(shù)使離子化效率達到最佳,9種目標(biāo)物都形成[M+H]+分子離子,并在二級質(zhì)譜中,產(chǎn)生兩個較為穩(wěn)定的子離子。具體參數(shù)見表1,MRM色譜圖見圖2。

表1 9種生物胺多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of MS/MS for the 9 biomamine amines(BAs)MRM mode

圖2 不同基質(zhì)中3種固相萃取柱生物胺回收率的比較Fig.2 Comparison of recovery rates of bioamines from 3 kinds of solid phase extraction columns in different substrates

圖3 9種生物胺對應(yīng)的定量離子和定性離子MRM色譜圖Fig.3 Quantitative and qualitative MRM chromatograms of 9 biogenic amines

2.4 線性關(guān)系和檢出限的考察

在本文所確定的色譜和質(zhì)譜條件下,對9種生物胺進行測定,用魚肉空白基質(zhì)配制一系列濃度為1～200 ng/mL,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過向陰性樣品中添加目標(biāo)物來考察方法的檢出限(S/N=3)、定量限(S/N=10),線性回歸方程、線性關(guān)系,具體見表2。通過表2可以看到目標(biāo)物在此線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)r≥0.999,線性相關(guān)良好,由于生物胺在液質(zhì)中響應(yīng)較高,且靈敏度不同,考慮到實際樣品中的含量,規(guī)定了如表2所見的線性范圍(1～200 ng/mL),檢出限(5 μg/kg)和定量限(15 μg/kg),能完全滿足實際樣品的測定。

表2 9種生物胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限(LOD)及定量限(LOQ)Table 2 Linear equations,coefficient of correlation,linear ranges,detection limit (LOD)and quantitative limit(LOQ)for the 9 biological amine

2.5 方法回收率和精密度驗證

選取水產(chǎn)品中南美白對蝦、梭子蟹、大黃魚、甲魚、鯽魚不同基質(zhì)陰性樣品分別添加15、30、50 μg/kg 3個不同濃度,每個濃度進行6次重復(fù)測定,考察方法回收率和精密度,從結(jié)果來看,該方法回收率在不同基質(zhì)中達到80.5%～109.5%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～5.9%,本方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度,其中養(yǎng)殖大黃魚中的加標(biāo)回收實驗結(jié)果具體見表3,其他數(shù)據(jù)不一一列出。

表3 基質(zhì)中9種生物胺加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 9 biogenic amine in blank matrix

2.6 實際樣品的測定結(jié)果

選取了市售的水產(chǎn)品中蝦、魚及甲魚共10份,在20、35 ℃下分別放置1、9 d進行9種生物胺含量測定,在20 ℃環(huán)境下放置1 d,有2 mg/kg左右濃度的組胺、酪胺、精胺、亞精胺和章魚胺的檢出,9 d后測定濃度增加不大,而在35 ℃環(huán)境下放置9 d,生物胺濃度迅速積累,新鮮程度劇烈下降,肉質(zhì)腐敗,其中組胺、尸胺、腐胺濃度最高,達到800～5000 mg/kg,苯乙胺、酪胺和章魚胺濃度達到100～300 mg/kg,亞精胺和精胺濃度變化不大,說明溫度對水產(chǎn)品組織中產(chǎn)生的生物胺有著重要的影響,也說明組胺、尸胺、腐胺可以作為評判水產(chǎn)品新鮮程度的主要指標(biāo)。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中9種生物胺含量的檢測方法,以0.2%甲酸乙腈為提取劑,用PriME HLB固相萃取柱凈化,通過HILIC色譜柱進行分離,在正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式下進行定量分析。結(jié)果顯示,9種生物胺在12 min內(nèi)得到分離,相關(guān)系數(shù)均達到0.999以上,方法檢出限為5 μg/kg,定量限為15 μg/kg,平均回收率在80.5%～109.5%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.3%～5.9%之間。說明該方法方法操作簡單,回收率高,重現(xiàn)性好,能夠準(zhǔn)確定性和定量低濃度生物胺,并且無須衍生,彌補了高效液相色譜法的不足,為進一步準(zhǔn)確評價水產(chǎn)品中的生物胺含量提供了豐富的技術(shù)手段。應(yīng)用本實驗確定的方法對在20、35 ℃下分別放置1、9 d實際樣品進行測定,發(fā)現(xiàn)組胺、尸胺、腐胺含量隨著時間和溫度的變化顯著增加,說明儲藏溫度和儲藏時間是影響生物胺在水產(chǎn)品中產(chǎn)生的重要條件,這也為進一步評價水產(chǎn)品的新鮮程度提供了理論依據(jù)。