郝經(jīng)文,徐文冬,石敏珠,陳乃富,*,陳乃東,*

(1.安徽中醫(yī)藥大學,安徽合肥 230031; 2.皖西學院,安徽六安 237012)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)與鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)均為蘭科石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物,分布于大別山區(qū)的安徽霍山、金寨、岳西、舒城,湖北英山等縣,具有益胃生津、滋陰清熱等作用,有很高的藥用價值和保健功效[1]。近年來,過度采挖及生長環(huán)境的破壞導致野生霍山石斛資源瀕臨滅絕,霍山石斛已被國家列為重點保護的藥用植物之一[2]。霍山石斛的野生資源匱乏,市場上多為霍山石斛和鐵皮石斛的栽培品[3]。且中藥材在種植過程中常用農(nóng)藥來防治各種害蟲,但農(nóng)藥的大量使用,不但污染生態(tài)環(huán)境,而且易導致藥材中農(nóng)藥殘留量超標,危及用藥安全,引起人體多種急慢性中毒[4]。因此,為了保障霍山石斛和霍山產(chǎn)鐵皮石斛的用藥安全,建立其多種農(nóng)藥殘留的同時測定方法具有重要意義。

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥(Pyrethroid pesticide)和氨基甲酸酯類農(nóng)藥(Carbamate insecticides)是廣譜型殺蟲劑,具有藥效快、殺蟲譜廣、易代謝、選擇性強等優(yōu)勢,在農(nóng)作物種植與中藥材栽培中被廣泛使用[5-6]。同時對上述2類農(nóng)藥殘留的檢測方法研究也日益受到人們重視。目前,國內外有關農(nóng)藥殘留的檢測方法主要為氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、活體生物測定法、原子吸收光譜法、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)等分析方法[7-14]。其中檢測農(nóng)藥殘留的GC-MS分析方法因具有準確、靈敏、快速、可同時測定多種農(nóng)藥殘留等優(yōu)點而被廣泛采用[15-17]。通過文獻調研,鐘冬蓮[18]使用氣相色譜分析方法對鐵皮石斛中的16種有機磷農(nóng)藥殘留進行了研究,王吉祥等[19]使用GC-MS/MS分析方法對鐵皮石斛中的19種農(nóng)藥殘留進行了研究分析,在對皖西地區(qū)中藥材種植的調查中發(fā)現(xiàn),在石斛栽培過程中擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥被廣泛使用,但對霍山石斛中該種類的農(nóng)藥殘留檢測研究相對較少。

本試驗采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法(GC-MS),在多選擇離子測試(SIM)模式下對霍山石斛及霍山產(chǎn)鐵皮石斛中16種農(nóng)藥殘留量進行測定,使用SPE固相萃取法和QuEChERS法凈化處理,排除復雜基體的測定干擾,建立霍山石斛和鐵皮石斛的農(nóng)藥殘留檢測方法,為霍山石斛及霍山產(chǎn)鐵皮石斛的質量安全提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石斛樣品 于2017年9月購自霍山太平畈,品種經(jīng)皖西學院陳乃東教授鑒定為霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)和鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo);正己烷、乙腈 純度>95%,美國Tedia試劑公司;二氯甲烷、丙酮 分析純,西隴化工股份有限公司;冰醋酸 分析純,江蘇強盛功能化學股份有限公司;NaCl 西隴化工股份有限公司;無水MgSO4天津博迪化工股份有限公司;無水Na2SO4上海安譜實驗科技股份有限公司;弗羅里硅土(Florisil)SPE小柱、N-丙基乙二胺(PSA)、C18粉、石墨化碳黑(GCB)及農(nóng)藥標準品:聯(lián)苯菊酯、甲氰菊脂、苯醚菊酯、胺菊酯、芐呋菊酯、殺蟲丹、猛殺威、速滅威、異丙威、滅蟲威、滅多威、抗蚜威、西維因、仲丁威、霜霉威、殘殺威 均購自中國上海安譜實驗科技股份有限公司。

Trace1300型氣相色譜儀-ISQ單四級桿質譜儀 美國Thermo Fisher公司；色譜柱:CP-Sil 19 CB(0.32 mm×50 m×0.2 μm) 美國Agilent 公司;氮吹濃縮裝置MTN-5800(220 V/50 Hz) 天津奧特賽恩斯儀器有限公司;立式高速冷凍離心機HR-T20MM 中國湖南赫西儀器裝備有限公司;VORTEX-5渦旋振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;S2-93自動雙重純水蒸餾器 上海亞榮生化儀器;FA1204B電子天平 上海越平科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理方法 石斛鮮條篩選干凈,取其莖,在40 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重,粉碎(過65目篩),備用,另取其莖,將其切碎并混勻,放入保鮮袋中于-20～16 ℃條件下保存。

1.2.1.1 SPE固相萃取法 準確稱取25 g(精確至0.01 g)石斛莖鮮品,切至成約0.2 cm小段,置100 mL離心管中,加入50 mL乙腈,5000 r/min勻漿提取2 min后,濾紙過濾,轉移濾液至100 mL容量瓶中,加入6 g NaCl,劇烈振蕩1 min,靜置30 min,移取上清液,10 mL于具塞試管中,于80 ℃下水浴,氮氣吹至近干,2 mL正己烷溶解定容,待凈化。

將提取液加入(Florisil)SPE固相萃取柱(預先用5.0 mL丙酮-正己烷(v/v=1∶9),5.0 mL正己烷淋洗),10.0 mL丙酮-正己烷(v/v=1∶9)洗滌,收集洗脫液于20 mL試管中,取5 mL洗脫液于試管中,50 ℃水浴,氮氣吹干,加正己烷溶解,定容至1 mL,得正己烷溶解液待用,另取5 mL于洗脫液于試管中,50 ℃下水浴,氮氣吹干,用1 mL二氯甲烷復溶,與上述正己烷溶解液混合均勻,用正己烷定容至2 mL,過濾檢測[20]。

1.2.1.2 QuEChERS法 準確稱取2 g(精確至0.01 g)石斛干粉樣品(過65目篩),置100 mL離心管中,加入10 mL雙蒸水,劇烈振蕩1 min,混勻,靜置10 min,加入10 mL(0.1%)醋酸-乙腈溶液,渦旋1 min,稱取1 g NaCl,6 g無水Mg2SO4,依次加入,渦旋1 min,以3500 r/min離心8 min,離心后取全部上清液,于-18 ℃環(huán)境下保存3 h,待凈化。

準確量取提取液3 mL,準確稱量0.45 g無水Mg2SO4、0.15 g PSA、0.15 g C18、0.15 g GCB依次加入,以3500 r/min離心8 min,取1 mL上清液于試管中,50 ℃水浴,氮氣吹干,加正己烷溶解,定容至1 mL,得正己烷溶解液待用,另取1 mL上清液于試管中,50 ℃下水浴,氮氣吹干,用1 mL二氯甲烷復溶,與上述正己烷溶解液混合均勻,用正己烷定容至2 mL,過濾檢測[21-22]。

1.2.2 GC-MS檢測方法 色譜條件:柱溫:110 ℃,保持1 min,以1.5 ℃/min升溫至120 ℃;再以10 ℃/min升溫至150 ℃,以5 ℃/min升溫至170 ℃,以0.1 ℃/min升溫至175 ℃,并以20 ℃/min升溫至228 ℃,以1.5 ℃/min升溫至254 ℃,以10 ℃/min升溫至277 ℃,以1 ℃/min升溫至278 ℃,以2 ℃/min升溫至295 ℃,保持4 min。載氣與流速:高純氦氣(純度:99.99%),1.00 mL/min;進樣量:1 μL;分流比:不分流進樣。

質譜條件:進樣口溫度200 ℃;電子轟擊離子化(EI)電離能量:70 eV;離子源溫度:300 ℃;傳輸線溫度:270 ℃;分析模式:選擇離子測試模式(SIM)。定量方式:總離子流(TIC)外標法定量,且16種農(nóng)藥化合物的保留時間、定量離子和定性離子,見表1。

表1 16種農(nóng)藥的保留時間和定性定量離子Table 1 Retention times,quantitative and qualitative ion for the 16 pesticides

1.2.3 標準曲線的繪制 分別稱取一定量的農(nóng)藥對照品,擬除蟲菊酯類用正己烷溶解,氨基甲酸酯類用二氯甲烷溶解,定容至25 mL,配成濃度為1000 μg/mL的對照儲備液,4 ℃下保存?zhèn)溆?。根?jù)試驗需要,精密量取標準儲備液混合,得到混合標準溶液。

將16種農(nóng)藥標準品儲備液,稀釋配制成含量分別為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μg/mL的標準溶液,在“1.2.2”項GC-MS條件下進行測定,以16種農(nóng)藥質譜特征離子峰為定性依據(jù),運用Trace1300-ISQ氣-質聯(lián)用儀配置的定量分析軟件,測得總離子流峰面積為縱坐標(Y),標準品濃度為橫坐標(X),繪制標準曲線。

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 精密度實驗 取單一農(nóng)藥對照品溶液濃度為40.0 μg/mL,按“1.2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,測定16種農(nóng)藥的進樣精密度。

1.2.4.2 穩(wěn)定性實驗 取單一農(nóng)藥對照品溶液濃度為40.0 μg/mL,按“1.2.2”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10 d進樣,測定峰面積,計算RSD,考察16種農(nóng)藥對照品穩(wěn)定性。

1.2.4.3 加樣回收實驗 精密稱取已測農(nóng)藥含量的石斛樣品12份,各5 g,分別置10 mL離心管中,加入“1.2.3” 項下混合對照品儲備液,按“1.2.1”項下方法制備檢測溶液,按“1.2.2”項下檢測條件測定峰面積,計算回收率和RSD。并比較 “1.2.1.1項及1.2.1.2項”兩種樣品制備和處理方法,各農(nóng)藥的平均回收率和相對標準偏差。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 23.0和Trace1300-ISQ氣-質聯(lián)用儀配置的定量分析軟件Thermo Xcalibur 2.2對實驗樣品農(nóng)殘檢測的結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜方法條件的選擇與優(yōu)化結果

本方法對16種農(nóng)藥具有良好的分離效果,可在40 min內完成一次分離。實現(xiàn)了16種農(nóng)藥的快速分離,滿足樣品中農(nóng)藥殘留的定性和定量分析要求。獲得16種農(nóng)藥混合標準溶液總離子流色譜圖(圖1)。

圖1 11種氨基甲酸酯類及5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥混合標準溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of 11 kinds of carbamate and 5 kinds of pyrethroid pesticide mixed standard solution 注:1.滅多威;2.殘殺威;3.猛殺威;4.霜霉威; 5.殺蟲丹;6.速滅威;7.異丙威;8.西維因; 9.滅蟲威;10.仲丁威;11.抗蚜威;12.芐呋菊酯; 13.聯(lián)苯菊酯;14.苯醚菊酯;15.胺菊酯;16.甲氰菊脂。

2.2 標準曲線及方法學考察

2.2.1 標準曲線 準確配制不同濃度的農(nóng)藥對照品溶液,在“1.2.1項下”檢測各農(nóng)藥的峰面積,計算各農(nóng)藥的濃度與峰面積的回歸方程及相關系數(shù),結果見表2。由表2所示,16種農(nóng)藥在5.0～80.0 μg/mL范圍內均具有良好的線性關系(R2>0.99),滿足試驗要求,在不含農(nóng)藥的石斛鮮條中添加混合標準溶液,按“1.2.1”方法對樣品進行處理,上機檢測。該方法的檢出限(LOD)為0.0001～0.0699 μg/mL,定量限(LOQ)為0.0003～0.2331 μg/mL(見表2)。

表2 16種農(nóng)藥單標的色譜相關系數(shù)、檢出限與定量限Table 2 Correlation coefficients(R2),LODs and LOQs for 16 pesticides

2.2.2 精密度試驗 16種農(nóng)藥測得峰面積的RSD均小于2.58%(見表3),說明儀器精密度良好。

表3 16種農(nóng)藥的精密度、穩(wěn)定性與加標回收率Table 3 Precision,stability and the recoveries of actual samples

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 結果8 d內16種農(nóng)藥對照品峰面積的RSD均達1.82%～2.97%(見表3),說明供試品衍生化溶液在8 d內穩(wěn)定。

2.2.4 加樣回收率試驗 比較“1.2.2.1項及1.2.2.2項”兩種樣品制備和處理方法,各農(nóng)藥的平均回收率和相對標準偏差,結果表明“1.2.2.1”項使用SPE固相萃取法進行處理樣品的回收率為84.87%～95.96%,相對標準偏差(RSD,n=6)為4.08%～7.66%(見表3),且“1.2.2.2項”使用QuEChERS法進行處理樣品的回收率為94.9%～104.91%(見表3),相對標準偏差(RSD,n=6)為2.23%～4.67%(見表3),且兩種方法穩(wěn)定可靠,能滿足農(nóng)藥殘留定量分析方法的技術要求。

2.3 樣品檢測結果

2.3.1 SPE法和QuEChERS法的測定結果 本試驗使用SPE固相萃取法和使用QuEChERS法對樣品進行富集純化,通過農(nóng)殘?zhí)卣麟x子峰掃描得到結果,且反復驗證結果均相同,得出本試驗所購霍山石斛及霍山產(chǎn)鐵皮石斛不含16種擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

由試驗結果可得:其中SPE固相萃取法是根據(jù)國家標準NY/T-761-2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》,回收率為84.87%～95.96%,相對標準偏差為4.08%～7.66%,當使用QuEChERS法進行樣品處理時,回收率為94.90%～104.91%,相對標準偏差為2.23%～4.67%,且兩種方法均穩(wěn)定可靠,都能滿足中藥材農(nóng)藥殘留定量分析方法的技術要求,但從試驗時間和成本考慮,SPE法處理樣品成本較高,且耗費的有機溶劑較多,操作相對繁瑣,因此當大量處理樣品時,為了節(jié)省人力物力,提高工作效率,可以選用QuEChERS法作為前處理方式。

3 結論

本試驗構建了氣相色譜-質譜(GC-MS)聯(lián)用技術測定霍山石斛及霍山產(chǎn)鐵皮石斛中16種擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的方法。石斛樣品以乙腈提取,使用SPE固相萃取法和QuEChERS法兩種方法分別凈化處理,該方法檢測16種農(nóng)藥殘留時,檢出限和定量限分別為:0.0001～0.0699和 0.0003～0.2331 μg/mL,精密度為:1.02%～2.58%,8 d內其穩(wěn)定性為:1.82%～2.97%,加樣回收率接近100%,故該方法靈敏度高,選擇性好,抗干擾性強,能夠很好的應用于霍山石斛及霍山產(chǎn)鐵皮石斛中多種農(nóng)藥殘留的分析,可為霍山石斛及霍山產(chǎn)鐵皮石斛的質量控制提供依據(jù),也為石斛類中藥材的農(nóng)藥殘留量檢測方法提供參考。